背景:人脐带来源的间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）由于没有伦理争议,干性高,且有更强增殖能力等优点在再生医学、组织工程和免疫调节等领域备受关注,是一种理想的细胞治疗产品。由于治疗所用的hUC-MSCs数量庞大,所以将细胞体外扩增培养后再进行应用是必经的过程,另外由于hUC-MSCs是一群具有高度异质性的细胞群体,临床应用效果差异大,所以对培养后的细胞进行质量控制也十分关键。目的:目前尚无高特异性和灵敏性的筛选标志物作为优质细胞的评估标准;本研究关注临床应用级别的培养后hUC-MSCs的多组学变化,试图能找到合适的标志物来作为hUC-MSCs的质量控制标准;同时解析hUC-MSCs的异质性的原因;为临床挑选合适的hUC-MSCs产品提供理论依据。方法:1.收集临床应用级别（无血清工程化培养）的同一条脐带的不同培养代次hUC-MSCs,进行了基因组、Bulk转录组、蛋白芯片以及甲基化芯片的测序和整合分析。2.整合得到可能导致细胞传代过程中衰老的基因,用qPCR、Western blot、慢病毒过表达和敲除、β-半乳糖苷酶染色、CCK8和细胞因子芯片等技术进行功能验证。3.用加权基因共表达分析方法（weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）分析两条脐带不同培养代次hUC-MSCs的Bulk转录组,以揭示培养过程中的细胞动态变化的转录组共性。4.将来自两条脐带的不同代次hUC-MSCs进行单细胞测序,以揭示培养过程中的亚群变化,细胞功能异质性,以及质控标志物。结果:1.hUC-MSCs在传代过程中基因组的变化主要以错义突变和拷贝数增加为主,主要影响细胞的发育、分化及DNA损伤修复,但不涉及癌基因,染色体片段缺失随传代增加发生率增高且片段增大,可能会导致细胞部分功能的缺失;转录组变化主要涉及细胞周期通路;甲基化基因的变化主要涉及分化、发育和损伤反应;蛋白质组变化的通路主要涉及免疫调节。2.将转录组、甲基化组和蛋白组测序数据加以整合,挑选出5个随传代上调的基因和5个下调基因加以功能验证,最终发现DGKA基因过表达会导致细胞衰老,过表达DGKA的hUC-MSCs中β-半乳糖苷酶阳性率增高,CCK8显示细胞增殖活力显著减弱,qPCR检测显示细胞周期阻滞基因p21和p16表达增加,qPCR和培养上清细胞因子检测表明DGKA使细胞出现明显的衰老分泌表型,免疫抑制相关基因的表达增加。3.WGCNA分析两条脐带的培养不同阶段共性变化的基因发现,早期培养阶段细胞主要激活免疫信号通路以及信号传导通路;中期培养阶段细胞主要激活通路涉及增殖、分化和炎症激活;晚期培养阶段细胞激活通路主要涉及骨化、凋亡和生长阻滞。挑选出了不同培养阶段细胞的hub基因,并发现早期培养阶段的细胞可能含有更多非MSCs的杂细胞。4.单细胞测序分析结果发现,去批次后的hUC-MSCs主要可被分为14个亚群,通过对不同亚群功能（GSVA分析与基因集打分）与干性（CytoTRACE）的综合分析,找到了干性与功能兼备的FOXA2+MLPH+LPXN+的C8亚群,以及衰老亚群C7（SEPT7+LPRC75A+CXCL6-）,并发现潜在的代表hUC-MSCs细胞干性的标志（MIF和CD59）。通过monocle拟时序分析及功能打分明确了不同祖系阶段的细胞亚群。通过SCENIC转录因子分析找到了衰老亚群转录因子KLF11的激活,DGKA是其下游的调控子之一,并发现成脂相关转录因子在G1期细胞亚群明显激活。结论:1、本研究从分子层面解析了不同培养代次的细胞功能差异。筛选的随传代次数递增及递减的基因可以作为细胞衰老程度的衡量标准。2、首次找到并证实了 DGKA是导致hUC-MSCs衰老的原因。3、联合不同供体来源的hUC-MSCs寻找出了代表不同培养阶段的核心基因,有望作为不同培养阶段hUC-MSCs产品的生物标志,用于不同适应症疾病的治疗。4、在单细胞转录组水平预测了不同亚群的功能,找到了功能与干性较好的亚群及衰老亚群,并找到了潜在的代表hUC-MSCs细胞干性的标志,对临床应用不同代次和亚群细胞进行不同疾病的针对性治疗具有重要意义。