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UL14蛋白是马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus, MDV)所编码的一种被膜蛋白,在疱疹病毒家族中是高度同源的。虽然UL14的基因编码区域与UL13有重叠,但重叠区域只编码长度可变、高度不保守的C端,高度同源的基因序列分布在不重叠的区域。在1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus1, HSV1)中,UL14不仅具有抗细胞凋亡的作用还具有热休克蛋白(Host shock protein, HSP)的功能并可以调节病毒的复制。马立克氏病(Marek’s Disease, MD)是由MDV引起的一种鸡的高度接触、传染性的恶性肿瘤性疾病,能够引起内脏和皮肤肿瘤,侵害中枢神经系统,是禽类重要的肿瘤性疾病之一。MD是研究肿瘤性疾病理想的动物模型。本研究应用基因芯片技术和荧光定量PCR方法检测MDV感染过程中UL14基因的动力学变化,发现UL14呈现显著的差异表达,且超强毒株RB1B与疫苗株CVI988的UL14表达表现不同的动力学变化。1.马立克氏病病毒基因在鸡胸腺组织中的转录表达图谱MDV是一种高度细胞结合性、致肿瘤性α疱疹病毒,以引起T细胞瘤为特征。通过基因芯片技术和生物信息学分析,在MDV感染后第7、14、21和28天的鸡胸腺中共鉴定出86个病毒基因。在感染后第7天,检测到47个MDV基因,这些基因主要涉及编码病毒粒子膜糖蛋白、包膜糖蛋白和核衣壳蛋白等。其中,大多数基因在感染后第21和28天高水平表达,而在第14天减少或关闭表达。这些结果提示MDV感染后在胸腺中建立潜伏感染期在第14天,该阶段仅有37个病毒转录物被检测到并且其表达丰度极低。本研究共检测到8个病毒被膜蛋白编码基因(UL11, UL14, UL21, UL36, UL37, UL46, UL47和UL49),其中,UL14表达差异极为显著,在感染后第14天下调表达,而后在21天显著上调(p<0.01),28天时又下调表达。对UL14基因进行进一步分析,结果表明L14蛋白与HSP70蛋白结构相近,并且在疱疹病毒家族中与人疱疹病毒等同源性较高。2.UL14蛋白的原核表达及多抗血清的制备为了进一步了解MDV感染过程中UL14蛋白的生物学作用,本研究用MDV RB1B毒株感染CEF细胞,然后以提取的感染细胞基因组DNA为模板,经PCR扩增出目的基因UL14,克隆入表达载体pET-32a,通过转化BL21(DE3)工程菌,经诱导剂IPTG诱导表达,结果表明,重组质粒pET-32a-UL14在大肠杆菌中能高效表达,表达的UL14融合蛋白具有可溶性。利用His柱纯化该融合蛋白,SDS-PAGE分析仅见约55kDa大小的UL14融合蛋白条带；Western blot结果表明,用此重组蛋白免疫BALB/c鼠后所得到的抗UL14多抗血清能与纯化的UL14融合蛋白反应并出现特异性条带。IFA分析显示,抗UL14多抗血清与MDV RB1B毒株感染的CEF细胞能够发生特异性反应。以上结果证实,本研究成功制备了MDV UL14融合蛋白及抗UL14多抗血清,为后续UL14蛋白生物学功能的研究提供了生物材料。3.UL14在马立克氏病病毒感染的CEF细胞及SPF鸡组织内的变化规律本研究用疫苗株CVI988和超强毒株RB1B分别感染次代CEF细胞,用荧光定量PCR方法检测UL14的基因表达水平,探讨了UL14在MDV感染过程中的动力学变化,结果发现,超强毒株RB1B与疫苗株CVI988的UL14在感染细胞内表达规律一致,均为72小时前逐渐上调,并在72小时上调极显著(P<0.01),然后下调；同时用Western blot检测的蛋白表达与基因表达水平一致。动物感染试验结果显示,在MDV超强毒株RB1B感染的SPF鸡胸腺和脾脏内,UL14的表达规律是一致的,在第14天下调,而后在第21天显著上调(p<0.01),接下来又下调,表现为下调-上调-下调的曲线表达,这与Meq的表达规律完全一致。荧光定量PCR的检测结果也与之前的基因芯片结果相一致。有趣的是,疫苗株CVI988感染的胸腺和脾脏组织内UL14表达量在第14天显著上调(p<0.01),这比RB1B感染组提前一周,而后在第21天和28天下调,说明MDV感染过程中不同毒力对UL14表达有影响。