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免疫检查点抑制剂可上调宿主的抗肿瘤免疫,但在大部分肿瘤患者中尚未受益,需探索新的方法增强免疫治疗的疗效,进一步改善肿瘤患者的治疗效果。热消融是通过射频、微波或者激光产生的热量进行肿瘤微创治疗的新兴方法;另一个主要作用是引发和促进肿瘤免疫。肿瘤经消融后可引起局部肿瘤凝结性坏死,释放大量肿瘤抗原,从而引发抗肿瘤T细胞免疫。扩增后的肿瘤特异性T细胞会向肿瘤局部靶向迁移,并最终清除肿瘤细胞。我们前期工作显示射频消融结合免疫检查点（PD-1）联合治疗在小鼠肿瘤模型可以有很好的协同作用,提示热消融作为免疫治疗具有极大的临床应用潜力。由于肿瘤细胞和细胞外基质中的内皮细胞、成纤维细胞等组成致密的肿瘤屏障,限制T细胞进入肿瘤组织。因此增加肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中T细胞的浸润是免疫治疗的关键。趋化因子是上皮细胞和免疫细胞分泌的细胞因子,其主要功能是调节免疫细胞向组织的迁移、归巢和定位,对于肿瘤免疫反应起至关重要的作用。本文重点研究趋化因子CXCL10（CXC-chemokine ligand 10,CXCL10）在肿瘤免疫治疗中的作用,通过CXCL10敲基因小鼠,检测CXCL10在热消融、免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade,ICB）治疗,以及微波消融（microwave ablation,MWA）联合免疫检查点治疗中的作用及机制,为建立肿瘤免疫治疗新模式提供实验基础和科学依据。第一部分CXCL10参与CD8+T细胞介导的抗肿瘤作用目的IL33的表达增强了肿瘤细胞的免疫原性,促进CD8+T细胞和NK细胞介导的I型抗肿瘤免疫反应。分析过表达IL33的B16（B16-IL33）黑色素瘤细胞中趋化因子家族的表达,探究趋化因子CXCL10在Ⅰ型抗肿瘤免疫反应中的作用。方法构建B16-IL33肿瘤细胞和其对照组B16-con肿瘤细胞荷瘤小鼠,记录小鼠肿瘤生长曲线;通过磁珠富集和流式细胞术分选荷瘤小鼠的肿瘤浸润CD8+T细胞,进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）,分析趋化因子家族的表达;构建C57BL/6背景下的CXCL10敲基因小鼠,检测其T细胞发育及体内稳态;磁珠富集分选C57BL/6小鼠和CXCL10敲基因小鼠脾脏和淋巴结（lymph nodes,LN）中的CD8+T细胞,通过体外实验检测CXCL10对CD8+T细胞增殖和活化的影响;将分选的CD8+T细胞过继转移至Rag2-/-小鼠,并接种B16-IL33肿瘤细胞,记录小鼠肿瘤生长曲线,流式细胞术检测肿瘤浸润淋巴细胞亚群的活化增殖以及效应分子的表达。结果B16-IL33黑色素瘤细胞荷瘤小鼠比对照组小鼠的肿瘤生长慢,小鼠生存期显著延长。通过磁珠富集和流式分选肿瘤浸润的CD8+T细胞,进行RNA-seq分析发现趋化因子家族成员CXCL10在B16-IL33荷瘤小鼠的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TILs）细胞中显著高表达。从南京大学模式动物研究所购买的CXCL10敲基因杂合子小鼠,通过繁育并进行PCR鉴定,得到CXCL10敲基因纯合子小鼠。对CXCL10敲基因小鼠的T细胞发育和体内稳态进行检测,与C57BL/6小鼠相比,CXCL10敲基因小鼠胸腺、脾脏和淋巴结中T细胞亚群的比例及效应功能无统计学差异的变化。通过磁珠富集分选C57BL/6小鼠和CXCL10敲基因小鼠脾脏和淋巴结的CD8+T细胞,体外培养48h后,流式分析发现CXCL10缺失会抑制CD8+T细胞的活化、增殖和效应功能。过继转移了 CXCL10敲基因小鼠CD8+T细胞的Rag2-/-小鼠比对照组小鼠的肿瘤生长快,且肿瘤浸润淋巴细胞减少,效应分子的表达降低。结论趋化因子CXCL10增强了 CD8+T细胞的活化、增殖和效应功能,并且在IL33促进CD8+T细胞介导的Ⅰ型抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。第二部分CXCL10在微波消融联合免疫检查点阻断治疗中的作用目的目前针对CTLA-4和PD-1的免疫检查点阻断治疗在临床上取得巨大的成功,但大部分肿瘤患者尚未从这种新型免疫疗法中获益。热消融会影响实体肿瘤微环境中的免疫细胞浸润到肿瘤组织,刺激持续的免疫反应。观察消融后对侧肿瘤组织内浸润淋巴细胞的基因表达差异,探究热消融介导的抗肿瘤作用中的影响因子。研究趋化因子CXCL10对增加TME中淋巴细胞的浸润,增强免疫检查点阻断治疗效果的影响,以及CXCL10在微波消融与免疫检查点阻断联合治疗中的作用。方法对胰腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）小鼠模型非射频消融（radio frequency ablation,RFA）治疗区肿瘤浸润CD45+免疫细胞的单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing,scRNA-seq）公共数据进行分析。在 C57BL/6 雄性小鼠背部双侧接种MC38结肠癌细胞,构建皮下移植瘤模型,分为消融治疗组和非消融治疗组,取小鼠的肿瘤组织制成单细胞悬液,通过磁珠富集和流式细胞术分选肿瘤浸润CD8+T细胞,进行RNA-seq分析。建立C57BL/6和CXCL10敲基因小鼠MC38结肠癌皮下荷瘤模型,在第4/8/12/16天用200μg的抗CTLA-4或抗PD-1单克隆抗体治疗,记录小鼠肿瘤生长,流式分析淋巴细胞亚群的比例及其效应分子的表达。另外将C57BL/6和CXCL10敲基因荷瘤小鼠分为4组:未治疗对照组、单独MWA治疗组、单独抗CTLA-4或抗PD-1治疗组和MWA与抗CTLA-4或抗PD-1联合治疗组,记录未消融区域的肿瘤大小,流式分析各治疗组非消融区域肿瘤内浸润淋巴细胞亚群的比例及其效应分子的表达。结果RFA治疗可增强CD8+T细胞的活性,尤其是细胞毒性CD8+T细胞,并通过促进CD8+T细胞的募集来增强抗肿瘤免疫应答。消融治疗组受趋化因子介导的信号传导调控基因在转录水平上表达更高。CXCL10/CXCR3通路在巨噬细胞与效应CD8+T细胞相互作用中显著富集,并在T细胞的募集和活化中发挥重要作用。CXCL10敲基因荷瘤小鼠的抗CTLA-4治疗组和对照组的肿瘤生长明显比C57BL/6荷瘤小鼠快。通过流式检测发现,与C57BL/6小鼠相比,CXCL10敲基因荷瘤小鼠的抗CTLA-4治疗组中肿瘤浸润的CD45+淋巴细胞和CD8+T细胞的比例明显减少,而CD4+T细胞和Treg细胞的比例变化无统计学差异,并且CD8+T细胞中INF-γ和TNF-α的表达下调。抗PD-1单克隆抗体在C57BL/6和CXCL10敲基因小鼠中的治疗结果与抗CTLA-4的结果一致。单独MWA治疗组和单独抗CTLA-4或抗PD-1治疗组均可对肿瘤生长产生一定程度的抑制作用,而联合治疗能显著抑制非消融区域肿瘤的生长;联合治疗组小鼠非消融区域肿瘤内的CD4+、CD8+T细胞浸润增加,且CD8+T细胞中IFN-γ和TNF-α的表达上调。与C57BL/6荷瘤小鼠相比,在同种治疗组中CXCL10敲基因小鼠的肿瘤生长快。并且流式分析发现,与C57BL/6荷瘤小鼠相比,CXCL10敲基因荷瘤小鼠的微波消融和抗CTLA-4联合治疗组中CD45+淋巴细胞和CD8+T细胞的比例明显降低,CD4+T细胞也略有减少,并且CD8+T细胞中IFN-γ和Ki-67的表达下调。结论热消融治疗可以促进淋巴细胞向肿瘤组织的浸润,从而增强抗肿瘤作用。RFA治疗可维持效应CD8+T细胞中CXCR3的表达,从而促进淋巴细胞向肿瘤组织中募集。巨噬细胞通过在肿瘤中产生CXCL10而对依赖CXCR3的T细胞的募集起关键作用,从而增强抗肿瘤作用。CXCL10能够增强CTLA-4和PD-1免疫检查点阻断治疗介导的抗肿瘤作用。CXCL10缺失使肿瘤浸润CD8+T细胞的效应功能减弱,证明了 CXCL10通过趋化CD8+T细胞浸润到肿瘤组织而发挥抗肿瘤免疫作用。微波消融联合抗CTLA-4免疫治疗可增强非消融侧TME中的抗肿瘤免疫反应,消融诱导的抗肿瘤免疫反应和肿瘤内淋巴细胞浸润依赖于趋化因子CXCL10。因此,CXCL10可通过CD8+T细胞参与微波消融与抗CTLA-4联合治疗的协同抗肿瘤作用。