论文部分内容阅读
目的:本研究主要目的是为了明确miR-146a、miR-155-5p在类风湿性关节炎(RA)发病中的作用,进而探讨其作用的分子机制,从而为RA等的炎性疾病的病理机制研究提供一个理论参考。研究方法:炎症功能细胞模型的构建:对三种与RA炎性反应密切相关的细胞:人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、人外周血单个核细胞(PBMCs)及类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞(HFLS-RA)采用脂多糖(LPS)刺激法或者通过miR-146a、miR-155-5p的模拟物瞬时转染法构建相关细胞模型。采用相对定量实时荧光定量PCR法(real-time PCR)检测靶细胞的两个炎性靶基因(TLR4及NF-κB)的动态表达,采用茎环引物-RT-qPCR的方法检测靶细胞的miR-146a、miR-155-5p的动态表达;继而利用SPSS17.0软件,采用t检验、单因素方差分析等方法分析研究miR-146a、miR-155-5p在细胞模型的炎性反应中的作用及其对炎症标志性分子TLR4和NF-κB的具体调控机制。研究结果:第一部分:HUVECs炎性细胞模型的构建及靶分子microRNA表达量变化研究:分别采用0.1,1,10μg/mL的LPS刺激HUVECs并检测LPS刺激0,4,8,12,24及48 h时各基因的表达变化,发现miR-146a、miR-155-5p、TLR4、NF-κB的表达均基本呈升高趋势。其中,TLR4、NF-κB的表达表现出一定的LPS浓度依赖性。且时间上,miR-155-5p的表达上调优先于miR-146a、TLR4与NF-κB。第二部分:病例(case)-对照(control)PBMCs模型建立及靶分子microRNA表达量变化研究:从RA患者及健康志愿者(HC)的血液标本中分离提取PBMCs,直接检测靶基因,发现与HC相比,RA患者中的miR-146a、miR-155-5p、TLR4表达均上调(p<0.05),而NF-κB表达无显著性差异(p>0.05)。用0.1μg/mL LPS分别刺激经过优化培养的PBMCs,刺激0,24,48,72 h或96 h后,HC的PBMCs中miR-155-5p、TLR4及NF-κB均在不同时间段有不同程度的上调(p<0.05),而miR-146a的表达则基本不变(p>0.05)。RA的PBMCs中TLR4均显著下调(p<0.01),miR-146a在24 h时显著上调达到峰值(p<0.05)后恢复原来水平,而miR-155-5p及NF-κB的表达基本无显著性差异(p>0.05)。第三部分:HUVECs和HFLS-RA细胞的miR-146a、miR-155-5p过表达模型构建及其调控作用研究:采用miR-146a及miR-155-5p模拟物瞬时转染HUVECs及HFLS-RA细胞,检测发现HUVECs中,以control组作为对照,miR-146a模拟物转染24 h时,miR-155-5p上调,TLR4、NF-κB基本不变;转染48h时,miR-155-5p、TLR4均显著上调(p<0.05),而NF-κB基本不变(p>0.05)。miR-155-5p模拟物转染24 h、48 h时,miR-146a、TLR4、NF-κB的表达均显著升高(p<0.05)。在HFLS-RA细胞中,以control组作为对照,miR-146a模拟物转染24 h时,miR-155-5p、TLR4及NF-κB的表达基本不变;转染48 h时,miR-155-5p、TLR4显著上调(p<0.05),NF-κB的表达无显著性差异。miR-155-5p模拟物转染24 h、48 h时,miR-146a、TLR4、NF-κB的表达均显著升高(p<0.05)。结论:经过本文实验,可以得出以下结论:1.miR-146a、miR-155-5p响应LPS诱导的炎症刺激2.miR-146a、miR-155-5p的表达与细胞的种类及所处状态密切相关3.miR-146a、miR-155-5p对于炎症反应的调控与细胞的炎性状态有关,在正常炎症反应过程中,miR-146a、miR-155-5p可协同调控NF-κB的表达,维持炎症稳态,但miR-146a的负调控作用具有剂量及时间依赖性。在非可控炎症反应中,miR-155-5p的促炎效应占主导作用,拮抗miR-146a对炎症反应的负向调控作用。