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自己构建好的海带(Laminariajaponica)雄配子体抑制消减cDNA文库中,通过Southern点杂交及序列分析,发现一未知功能的差异表达基因片段(克隆b9)。根据该克隆序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends,RACE),自雄配子体中克隆了一条长831bp的cDNA序列,其中开放阅读框450bp,5-非翻译区182bp,3-非翻译区199bp且具有明显的poly(A)尾巴。它编码含149个氨基酸的蛋白,其分子量为17.2kD,等电点为10.46。同样利用PCR方法自雌配子体中克隆了该基因的cDNA序列,它与雄配子体中的完全一致。根据srp基因的cDNA序列设计引物,自海带雌、雄配子体基因组中扩增其DNA序列,经序列分析可知该基因在ORF区域不存在内含子。这些结果说明srp基因同时存在于海带雌、雄配子体的细胞中,且在cDNA序列上没有差异。
使用核甘酸序列同源搜索,无匹配。蛋白同源搜索结果显示,该基因编码蛋白与点形念珠藻(Nostocpunctiforme)含有SpoIID/LytB结构域蛋白(SpoIID/LytBdomain-containingprotein:一种孢子形成时起作用的蛋白质)具有30%相似性,故暂命名为孢子形成相关蛋白基因(sporulation-relatedproteingene,srp)(GenBank登录号:EF490313)。
利用生物信息学对SRP蛋白的结构和功能进行了预测,发现组成它的氨基酸多为中性和碱性,且疏水性氨基酸占41.6%,说明SRP蛋白具有较强的疏水性。另外,SRP蛋白无信号肽,但它具有N-肉豆蔻酰基化、cAMP与cGMP依赖型蛋白激酶磷酸化、蛋白激酶C磷酸化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化以及N-糖基化等位点。
在克隆srp基因的cDNA全长序列后,构建了它原核表达载体pET-28a-srp,并将其转化至大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21中,获得了分子量大小约19.3kD的目的表达蛋白(含His标签),且表达量与诱导物IPTG的量成正比。通过高效液相-质谱分析证实,重组蛋白的氨基酸序列与基于cDNA序列推测蛋白的氨基酸序列一致。
以重组SRP蛋白为抗原对兔子进行免疫以获得多克隆抗体,利用该抗体并运用Western印迹技术,在海带配子体中证实天然SRP蛋白的存在。
本研究的结果证实了srp基因所编码蛋白确实存在于海带配子体细胞中,以发挥相应的作用。有关SRP蛋白在海带配子体生长与发育过程所起的作用,以及为什么在雌、雄配子体之间存在差异表达等问题,有待于在配子体SRP蛋白分离及性质分析后,利用RNAi或基因敲除等手段来进一步探讨。