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水稻籽粒发育是一个复杂的细胞生理过程,始源于双受精作用,包含许多物质和能量代谢,其发育的过程可分为细胞组织分化、干物质积累和籽粒成熟干燥三个连续的发育时间段,涉及到大量的基因表达与调控,而蛋白质间的相互作用对籽粒发育过程中关键基因的表达与功能的发挥起到了重要的调控作用。14-3-3蛋白是高度保守并普遍存在于真核生物中的一类调节蛋白,通过识别特异的磷酸化序列与靶蛋白相互作用在蛋白互作级联中发挥调控作用。植物14-3-3蛋白通过与多种功能蛋白结合互作,参与植物的多种信号转导、初级代谢、逆境响应以及物质运输等生理过程,在植物生长发育中具有重要的调控作用。然而,至今为止,14-3-3蛋白在水稻籽粒发育过程中的作用及其调控机制未见报道。本研究首先通过同源性和亲缘性分析,发现水稻14-3-3蛋白分为两组,OsGF14-A～F6个亚型蛋白属于非ε型,OsGF14-G和OsGF14-H属于ε型,8个亚型蛋白间表现出高度保守性,其主要的差异在C端和N端,结果表明水稻14-3-3各亚型蛋白具有不同的功能,两端的差异是导致蛋白功能分化的主要原因。基于Rice Annotation Project Database(RAP-DB)数据库的转录本分析发现8个水稻14-3-3家族基因中,OsGF14～f 6个基因在籽粒发育初期展现出丰富的表达水平。进一步采用RT-PCR分析发现这6个基因中,OsGF14-b和OsGF14-e2个基因随着水稻籽粒的发育而呈现逐步上调表达的趋势,说明OsGF14-b和OsGF14-e与水稻籽粒发育密切相关。此外,RT-PCR结果还表明水稻籽粒中OsGF14-b和OsGF14-e在外界环境改变(高温、低温)和激素处理(ABA、IAA、GA、ZT、BR)响应中均出现不同程度的表达变化。可见,OsGF14-b和OsGF14-e在水稻籽粒发育和环境响应中各自起着重要的调控作用。为了明确OsGF14-B和OsGF14-E蛋白在水稻籽粒发育中的作用及其调控机制,本研究进一步采用GST pull-down技术分别捕获OsGF14-B和OsGF14-E在水稻发育籽粒中的互作靶蛋白,共鉴定到64个与OsGF14-B和83个与OsGF14-E互作的靶蛋白。同时对互作靶蛋白进行了磷酸位点和转录相关性分析,结果表明所有靶蛋白均与OsGF14-B和OsGF14-E蛋白存在一定关联性。进一步对互作靶蛋白进行 Gene Ontology(go)分析和 pathway 分析,发现 OsGF14-B 和 OsGF14-E通过与靶蛋白结合互作,分别参与水稻籽粒发育的13和11种细胞生理过程,包括蔗糖转化、淀粉合成、糖酵解、蛋白合成、细胞的生长分裂和病害防御等籽粒发育中重要的能量物质代谢和防御过程,表明OsGF14-B和OsGF14-E蛋白通过参与多种复杂的生理生化过程,在水稻籽粒发育中发挥重要的调控作用。进一步分析发现OsGF14-B和OsGF14-E蛋白有43个相同的互作靶蛋白,表明上述2个14-3-3家族蛋白在水稻籽粒的发育中有着相同调控机制。例如,OsGF14-B和OsGF14-E蛋白均能够与蔗糖合酶、果糖激酶、AGP焦磷酸化酶、淀粉支酶等蔗糖淀粉转化中关键蛋白结合互作,调控籽粒中蔗糖转化和淀粉合成;均能够与UPG焦磷酸化酶、果糖-二磷酸醛缩酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和苹果酸脱氢酶等糖酵解和TCA关键酶相互作用,调控籽粒发育的糖酵解和TCA途径。同时,还发现OsGF14-B和OsGF14-E蛋白之间能够相互结合,并这两蛋白均能够与其它的14-3-3蛋白结合相互作用,表明OsGF14-B和OsGF14-E蛋白协同调控水稻籽粒的发育过程。此外,也发现OsGF14-B和OsGF14-E蛋白分别有18个和29个特异结合的靶蛋白。进一步pathway分析,发现这两个蛋白的特异蛋白涉及蛋白合成、氨基酸代谢和细胞生长分裂等多种籽粒发育重要的生理过程,且这两个蛋白在不同的生理过程具有特异的调控机制。例如在蛋白合成中,OsGF14-E蛋白特异与氨肽酶M1和核糖体蛋白S6结合,而OsGF14-B蛋白特异与ADP核糖基化因子1和真核起始因子4A结合;在细胞生长分裂中,OsGF14-E蛋白特异结合多种亚型的肌动蛋白,而OsGF14-B蛋白特异与肽基脯氨酰基顺反异构酶结合互作。进一步分析,也发现OsGF14-B蛋白的互作靶蛋白中有20%集中于主要CHO代谢中,13%、12%和10%集中于糖酵解、蛋白合成和病害防御;而OsGF14-E蛋白的互作靶蛋白有20%集中于蛋白合成,17%、14%和11%集中于主要CHO代谢、糖酵解和细胞生长分裂。通过亚细胞定位预测分析,发现两个蛋白的靶蛋白展现出不同的亚细胞定位图谱。上述结果表明,OsGF14-B和OsGF14-E蛋白在介导水稻籽粒发育的过程中,具有各自特异的调控机制。以上结果初步揭示了水稻14-3-3蛋白家族成员OsGF14-B和OsGF14-E在籽粒发育过程中的调控机制,深化了对水稻籽粒发育的认识,为定向改良优良基因实现水稻高产提供了理论依据。