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目的:血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs）增殖及表型转化是动脉粥样硬化发生与发展的关键始动因素之一。血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）可以诱导多种生物学效应并促进血管平滑肌细胞的增殖与表型转化。西红花苷（Crocin）是药用植物藏红花（Crocus Sativus L.）的主要功能成分之一,研究显示其具有抑制动脉粥样硬化斑块形成的功效。然而,crocin对血管平滑肌细胞增殖及表型转化的影响尚不明确。本研究目的在于探索crocin对PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖及表型转化的影响及其潜在机制。研究方法:1、研究对象:SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（来源于大鼠胸主动脉血管中膜平滑肌细胞原代培养）。2、实验分组与药物处理:（1）.测定crocin对VSMCs有无细胞毒性作用。VSMCs依据干预因素分为对照组、crocin（10μM）组、crocin（50μM）组、crocin（100μM）组,药物处理24小时及48小时后CCK-8测定VSMCs增殖率。（2）.测定crocin对PDGF-BB诱导的VSMCs增殖及表型转化的影响。VSMCs依据干预因素分为对照组、PDGF-BB（20ng/ml）组、PDGF-BB（20ng/ml）+crocin（10μM）组、PDGF-BB（20ng/ml）+crocin（50μM）组、PDGF-BB（20ng/ml）+crocin（100μM）组,药物处理24小时后CCK-8测定VSMCs增殖率,Western Blot测定VSMCs收缩表型标志蛋白:平滑肌肌动蛋白-α（α-SMA）、调宁蛋白（calponin）及合成表型标志蛋白:骨桥蛋白（OPN）的表达水平,免疫荧光染色观测VSMCs胞内α-SMA平均免疫荧光强度及肌原纤维排列。（3）.测定PDGF-BB对JAK/STAT3通路的作用。VSMCs依据干预因素分为对照组、PDGF-BB（20ng/ml）组、PDGF-BB（20ng/ml）+AG490（10μM）组、AG490（10μM）组（AG490:JAK抑制剂）,药物处理24小时后Western Blot测定JAK/STAT3通路蛋白p-STAT3（p-:磷酸化的）及总STAT3的表达水平。（4）.测定PDGF-BB对ERK/KLF4通路的作用。VSMCs依据干预因素分为对照组、PDGF-BB（20ng/ml）组、PDGF-BB（20ng/ml）+U0126（50μM）组、U0126（50μM）组（U0126:ERK1/2抑制剂）,药物处理24小时后Western Blot测定ERK/KLF4通路蛋白p-ERK1/2、总ERK1/2及KLF4的表达水平。（5）.测定crocin对JAK/STAT3通路及ERK/KLF4通路的作用。VSMCs依据干预因素分为对照组、PDGF-BB（20ng/ml）组、PDGF-BB（20ng/ml）+crocin（10μM）组、PDGF-BB（20ng/ml）+crocin（50μM）组、PDGF-BB（20ng/ml）+crocin（100μM）组,药物处理24小时后Western Blot测定JAK/STAT3通路蛋白p-JAK1、总JAK1、p-JAK2、总JAK2及p-STAT3、总STAT3的表达水平及ERK/KLF4通路蛋白p-ERK1/2、总ERK1/2及KLF4的表达水平。（6）.测定JAK/STAT3通路及ERK/KLF4通路是否介导了PDGF-BB诱导的VSMCs增殖及表型转化。VSMCs依据干预因素分为对照组、PDGF-BB（20ng/ml）组、PDGF-BB（20ng/ml）+crocin（100μM）组、PDGF-BB（20ng/ml）+AG490（10μM）组、PDGF-BB（20ng/ml）+U0126（50μM）组,药物处理24小时后CCK-8测定VSMCs增殖率,Western Blot测定VSMCs收缩表型标志蛋白α-SMA、calponin与合成表型标志蛋白OPN的表达水平。3、SD大鼠血管平滑肌细胞取材与原代培养:成熟雄性SD大鼠,体重:160-180g,麻醉后经胸部解剖,剪取胸主动脉段血管,显微镜下分离动脉中膜并剪成约1mm2的组织块,贴附于培养瓶壁,加入含10%FBS的DMEM培养基,37?C,5%CO2孵箱中孵育至VSMCs从组织块中爬出,换液,传代,取第5-9代生长良好的VSMCs应用于后续实验。4、CCK-8实验:将无血清培养24小时后的VSMCs接种于96孔板,5000个细胞/孔。依据分组条件添加不同的药物干预,继续孵育24小时后,向每孔中加入10μl的CCK-8溶液,在37?C下再孵育2小时。酶标仪测定450nm处VSMCs的吸光度并计算细胞增殖率。5、Western Blot实验:VSMCs依据分组条件经药物处理后,用含PMSF的RIPA裂解液裂解细胞,提取总蛋白,BCA法测定蛋白质浓度并绘制标准曲线,计算上样量及上样体积。蛋白变性后上样并进行SDS-PAGE、转膜（PVDF膜,湿转）,然后用脱脂牛奶室温下封闭。TBST洗膜后,加入一抗,摇床孵育过夜。然后加入HRP标记山羊抗兔/抗鼠二抗,室温下孵育1小时后,ECL发光,自动显影仪进行目的蛋白显影,Image J软件进行条带灰度值分析。6、免疫荧光染色实验:VSMCs依据分组条件经药物处理后,4%多聚甲醛固定爬片,0.1%Triton X-100室温下通透,再用2%BSA封闭后,加入抗α-SMA抗体,孵育过夜。然后加入山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor?488荧光二抗室温下再孵育1小时。最后,加入DAPI染核。荧光显微镜下观察图像。Image J软件分析α-SMA平均免疫荧光强度。7、统计学分析:所有实验重复至少3次,结果以均数±标准差表示,使用单因素方差分析（one-way ANOVA）/Tukey事后检验（Tukey’s post hoc test）进行统计学分析。P<0.05有显著性差异。结果:1、血管平滑肌细胞取材与原代培养:SD大鼠胸主动脉中膜组织块放入含DMEM培养基的培养瓶中孵育,三天后可见VSMCs从组织块中爬出,继续培养至第六天,VSMCs生长至基本融合,呈现典型的“谷-峰”样生长。VSMCs形态呈梭形、菱形、纺锤形或多边形。2、Crocin对VSMCs不具有细胞毒性:CCK-8结果显示,与对照组比较,无论crocin的干预浓度（10μM、50μM、100μM）及处理时间（24小时、48小时）,VSMCs增殖率均没有受到显著影响（P>0.05）。3、Crocin抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖:CCK-8结果显示,与对照组比较,VSMCs经PDGF-BB诱导后增殖率显著升高（P<0.05）,但在加入crocin干预后,与PDGF-BB组比较,VSMCs增殖率被逐渐抑制（P<0.05）,且抑制程度与crocin的浓度呈依赖性正关系。4、Crocin抑制PDGF-BB诱导的VSMCs表型转化:Western Blot结果显示,与对照组比较,VSMCs经PDGF-BB诱导后收缩型蛋白α-SMA及calponin表达显著降低,而合成型蛋白OPN表达增高（P<0.05）。但加入crocin干预后,PDGF-BB的诱导作用逐渐被抵消,α-SMA与calponin的表达重新增强,而OPN的表达则受到抑制（P<0.05）,并且抑制程度与crocin的浓度呈依赖性正关系。5、Crocin增强VSMCs胞内α-SMA平均免疫荧光强度并改善PDGF-BB诱导的肌原纤维排列紊乱:免疫荧光染色结果显示,与对照组比较,PDGF-BB不仅降低了α-SMA的平均免疫荧光强度（P<0.05）,同时还干扰了细胞内肌原纤维的排列顺序,导致肌原纤维排列紊乱,失去规则性。但添加crocin干预后,α-SMA平均免疫荧光强度逐步增强（P<0.05）,且增强程度与crocin的浓度呈依赖性正相关,此外,肌原纤维的排列紊乱也得到了逐步改善并恢复规则。6、PDGF-BB能够激活JAK/STAT3及ERK/KLF4信号通路:Western Blot结果显示,与对照组比较,VSMCs经PDGF-BB处理后p-STAT3表达增强,p-STAT3/总STAT3比值也相应增高（P<0.05）,但在添加AG490干预后,p-STAT3的表达受到抑制,p-STAT3/总STAT3比值也相应降低（P<0.05）。同样,与对照组比较,PDGF-BB增强p-ERK1/2及KLF4的表达,提高p-ERK1/2/总ERK1/2比值（P<0.05）,在添加U0126干预后,p-ERK1/2及KLF4的表达均受到抑制,p-ERK1/2/总ERK1/2比值也相应降低（P<0.05）。7、Crocin抑制PDGF-BB激活JAK/STAT3及ERK/KLF4信号通路:Western Blot结果显示,与对照组比较,VSMCs经PDGF-BB诱导后p-JAK1、p-JAK2和p-STAT3的表达增强,p-JAK1/总JAK1、p-JAK2/总JAK2、p-STAT3/总STAT3比值增高（P<0.05）,但加入crocin干预后,p-JAK1、p-JAK2和p-STAT3的表达均受到抑制,p-JAK1/总JAK1、p-JAK2/总JAK2、p-STAT3/总STAT3比值也相应降低（P<0.05）,且抑制程度与crocin的浓度呈依赖性正相关。同样,PDGF-BB显著提高p-ERK1/2及KLF4的表达水平及p-ERK1/2/总ERK1/2比值（P<0.05）,但在添加crocin后,p-ERK1/2与KLF4的表达受到抑制,p-ERK1/2/总ERK1/2比值也相应降低（P<0.05）,并且抑制程度与crocin的浓度呈依赖性正相关。8、JAK/STAT3及ERK/KLF4通路介导了VSMCs增殖及表型转化:CCK-8结果显示,VSMCs经PDGF-BB处理后,增殖率增高（P<0.05）,但应用AG490阻断JAK/STAT3通路及应用U0126阻断ERK/KLF4通路后,PDGF-BB的促增殖作用被抵消,VSMCs的增殖率显著降低（P<0.05）。同样,应用crocin同时阻断这两条通路也显著降低了VSMCs的增殖率（P<0.05）。Western Blot结果显示,PDGF-BB降低收缩型蛋白α-SMA、calponin的表达并增强合成型蛋白OPN的表达（P<0.05）,但在JAK/STAT3通路及ERK/KLF4通路被AG490与U0126阻断后,PDGF-BB的作用被抵消,α-SMA、calponin的表达重新增强,OPN的表达则受到了抑制（P<0.05）。同样,应用crocin同时阻断这两条通路也增强了收缩型蛋白α-SMA、calponin的表达,降低了合成型蛋白OPN的表达（P<0.05）,即抵消了PDGF-BB的表型转化诱导作用。结论:1、PDGF-BB能够激活VSMCs的JAK/STAT3通路和ERK/KLF4通路。2、JAK/STAT3通路和ERK/KLF4通路介导了PDGF-BB诱导的VSMCs增殖及表型转化。3、Crocin通过抑制JAK/STAT3和ERK/KLF4通路发挥抗VSMCs增殖及表型转化的作用。4、Crocin能增强VSMCs胞内α-SMA的表达强度并恢复肌原纤维排列的规则性,改善合成型VSMCs受损的收缩功能。5、Crocin对VSMCs不具有细胞毒性。