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随着喉微创技术的应用及普及,目前可以在显微镜下借助激光等手段切除声带早期病变,但病变切除的同时,若造成了声带固有层的缺失,术后疤痕形成,就会影响患者的发音。声带疤痕已成为我们迫切需要改善并解决的一个重要问题。干细胞注射作为治疗声带疤痕的一种新的治疗手段,为我们带来了希望。人们尝试利用骨髓间充质干细胞、肌源性干细胞及脂肪基质干细胞等不同的成体干细胞来治疗声带疤痕,但是因为应用以上的干细胞存在着取材困难,细胞植入后形成的组织结构差异大等缺点,因此,目前还没有发现理想的,令人满意的干细胞治疗手段。近年来随着干细胞研究的不断深入,人们发现在成熟的高等动物体内广泛存在着间充质干细胞,而且它们还参与了不同组织的形成与发展。因此,本研究的目的是为了确定声带固有层和会厌黏膜固有层中是否均存在着间充质干细胞,并且通过MTT和克隆形成实验等方法比较声带间充质干细胞和会厌黏膜间充质干细胞的生物学特性,寻找一种能够用于声带组织工程修复的理想的间充质干细胞。1目的探讨声带固有层和会厌黏膜固有层中是否存在间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC),并对其进行分离培养及鉴定,比较其生物学特性,为喉部组织的创伤修复提供新的细胞来源。2方法2.1喉黏膜间充质干细胞(Laryngeal mucosa mesenchymal stem cells,LM-MSC)的分离培养及鉴定2.1.1声带间充质干细胞(Vocal fold mesenchymal stem cells,VF-MSC)的分离培养及鉴定:从喉癌手术患者术中切下的组织中获取正常声带固有层,利用组织块培养法获得固有层来源的细胞,利用流式细胞仪对其进行表面标志物的分析,及利用成脂、成骨诱导液对其进行多项分化能力的研究。2.1.2会厌黏膜间充质干细胞(Epiglottis mucosa mesenchymal stem cells,EP-MSC)的分离培养及鉴定:从喉癌手术患者术中切下的组织中获取正常会厌舌面黏膜,利用消化培养法获得固有层来源的细胞,利用流式细胞仪对其进行表面标志物的分析,及利用成脂、成骨、成神经诱导液对其进行多项分化能力的研究。2.2声带间充质干细胞与会厌黏膜间充质干细胞的生物学特性比较绘制细胞生长曲线比较hVF-MSC和hEP-MSC的生长增殖情况,采用平板克隆形成试验,比较其克隆形成能力。取第4代正常的hVF-MSC和hEP-MSC贴壁培养后加入含有VitC的膜片培养液,培养2w后用显微镊将膜片撕下,置于培养皿中继续培养至膜片缩成团状。将细胞团移植于裸鼠皮下2w后取材,取材后行H&E和免疫组化Vimentin染色,观察细胞在裸鼠体内的存活及生长情况。2.3炎症微环境对会厌黏膜间充质干细胞的影响通过在培养液中加入IL-1β和TNF-α来模拟炎症微环境。细胞被分为两组,一组是加入炎症因子的炎症组,另一组是使用正常培养液的对照组。实验的主要内容包括:①MTT试验观察急性炎症对细胞增殖的影响。②流式细胞仪测定诱导7天炎症微环境对细胞凋亡和周期的影响。③实时定量PCR测定炎症微环境对胶原相关基因表达的影响。3结果3.1喉黏膜间充质干细胞的分离培养及鉴定3.1.1声带间充质干细胞的分离培养及鉴定:原代培养3d左右,细胞开始贴壁,成短梭形,贴壁24h细胞伸展成长梭形,形态类似成纤维细胞,但是胞突的形态更加细长,核较大,呈椭圆形。利用流式细胞仪对其进行表面标志物的分析,hVF-MSC高表达间充质干细胞的表面标志(CD29-57.3%、CD44-99.1%、CD90-97%、CD105-26%、CD146-4.8%),不表达造血系(CD34-0.9%、CD45-0.4%)的表面标志。在体外分别经成脂、成骨诱导分化后,油红O染色阳性,茜素红染色阳性。3.1.2会厌黏膜间充质干细胞的分离培养及鉴定:原代培养3 d左右,细胞开始贴壁,成短梭形,贴壁24 h后细胞伸展成长梭形,形态类似成纤维细胞,核较大,呈椭圆形。利用流式细胞仪对其进行表面标志物的分析, hEP-MSC高表达间充质的表面标志(CD29-16.9%、CD44-97.4%、CD90-89.5%、CD105-85.9%、CD146-2.5%、stro-1-20.4%),不表达造血系(CD34-1.2%、CD45-0.8%)的表面标志。在体外分别经成脂、成骨和成神经诱导分化后,油红O染色阳性,茜素红染色阳性,神经细胞特异性抗原S100呈阳性表达。3.2绘制细胞生长曲线(MTT)可以观察到在4至7天hVF-MSC较hEP-MSC有较快的生长增殖速度(P<0.05)。通过平板克隆形成试验可以发现hVF-MSC较hEP-MSC具有更高的克隆形成能力(P< 0.05),两者均可以形成不同形态和大小的克隆。hVF-MSC和hEP-MSC均可成功的培养出膜片,裸鼠背部正中皮下体内移植2w后取材。H&E染色的结果显示细胞在体内生长良好且无炎症反应,免疫组化Vimentin染色的结果可以观察到细胞在体内的分布情况,细胞团结构清晰两者没有明显的差异。3.3炎症微环境对会厌黏膜间充质干细胞的影响MTT实验观察急性炎症对hEP-MSC生长增殖能力的影响。利用吸光值绘制生长曲线,比较hEP-MSC在炎症和正常条件下培养5d细胞的增殖能力。炎症组与正常组相比,增殖明显加快(p<0.05)。但诱导7天的细胞周期检测结果显示,炎症组G0G1(69.55%)期较高,而S(29.0%)和G2M(1.45%)较对照组(S=29.4%, G2M=7.52%, G0G1=63.08%)低。炎症7天可使细胞周期阻滞于G0/G1期,降低S和G2/M期细胞比例,提示炎症7天已经开始抑制细胞的增殖,阻滞了细胞周期进程,影响了其复制。细胞凋亡诱导7天的结果显示,炎症组(2.5%)比正常组(1.7%)的凋亡比例更高。对炎症诱导的hEP-MSC在4个不同时间点(6h,12h,24h,48h)进行实时定量PCR测定,COL-1的表达量均下降,COL-3的表达量在24h内下降,48h明显上升。MMP-1的表达量在所有的时间点均上升(P < 0.05)。4结论4.1本实验利用组织块培养法成功地培养鉴定了声带间充质干细胞,并证明了其具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力。利用消化培养法成功地培养鉴定了会厌黏膜间充质干细胞,并证明了其具有向脂肪细胞、成骨细胞及声带间充质干细胞与会厌黏膜间充质干细胞的生物学特性比较神经细胞分化的能力。4.2声带间充质干细胞较会厌黏膜间充质干细胞有较快的生长增殖速度和较好的克隆形成能力。两种细胞膜片裸鼠体内移植的结果初步显示,hVF-MSC和hEP-MSC均可用于体内实验,且细胞可以在体内正常生长,为hEP-MSC应用于大型动物的体内试验提供了良好的证据。4.3炎症因子诱导早期,hEP-MSC的生长增殖能力与对照组相比明显加快。诱导7天后,细胞凋亡结果显示炎症可以导致细胞的凋亡明显增加,细胞周期的结果显示炎症可以导致细胞处于增殖期的数量减少。通过对炎症诱导的hEP-MSC进行实时定量PCR测定发现,在炎症的诱导下,48h时Col-1的表达量下降至最低,这将会影响后期声带修复所应具有的正常的强度和韧性,而Col-3在48h时的表达量过高也不利于声带恢复其正常的粘弹性。