低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)是重要的功能性益生元,具有调节人体肠道菌群平衡、促进矿物吸收、降低血脂等生理功能,被广泛应用于食品、医药及动物饲料等领域。工业上通常采用微生物酶法进行低聚果糖生产,黑曲霉ATCC 20611是目前工业生产低聚果糖的主要菌株。在蔗糖诱导条件下,该菌株产生具有果糖基转移活性的β-呋喃果糖苷酶FopA,将高浓度蔗糖转化生成低聚果糖,该反应过程为可逆反应,低聚果糖最终浓度仅能达到50%-60%。目前β-呋喃果糖苷酶基因的具体功能仍不清楚,特别是蔗糖对该基因表达的诱导特性也未充分发掘。另外,废糖蜜是制糖过程中的废料且含有一定量蔗糖,筛选废糖蜜生境下低聚果糖合成菌株不仅有利于丰富菌种资源而且有利于低成本生产饲料用低聚果糖。本论文首先以黑曲霉ATCC 20611为研究对象,对β-呋喃果糖苷酶基因fopA进行敲除,并对敲除菌株的碳源利用和产酶特性进行分析,发现该菌株不能在蔗糖为碳源的察氏培养基和发酵培养基中生长,也无法生产β-呋喃果糖苷酶,因此敲除该基因后菌株不能利用蔗糖,说明该基因是黑曲霉ATCC 20611中负责利用蔗糖的关键基因;之后进一步利用该敲除菌株能利用葡萄糖、果糖但不能利用蔗糖和低聚果糖的特点,将敲除菌株应用于低聚果糖的合成优化实验,最终将低聚果糖由浓度56%提升为87%,实现了高浓度低聚果糖的合成。然后,本文利用fopA基因启动子PfopA表达葡萄糖氧化酶优化低聚果糖合成。首先选取绿色荧光蛋白和葡萄糖苷酶为模式蛋白,检测该启动子是否可以成功进行外源蛋白表达。荧光显微镜下观察到的结果显示,在蔗糖诱导条件下,该基因启动子PfopA可以成功表达外源蛋白;然后选择分泌型外源蛋白β-葡萄糖苷酶BGL1为模式蛋白检测该基因是否可成功表达外源分泌蛋白。七叶苷平板的结果显示,转化株的显色反应十分明显,甚至高于阳性对照;葡萄糖苷酶发酵酶活结果显示,表达BGL1的转化株中酶活最高可达70 U/ml,而出发菌株无酶活;蛋白电泳结果中转化菌株的胞外蛋白条带单一且明显。为在黑曲霉ATCC 20611中实现β-呋喃果糖苷酶FopA葡萄糖氧化酶GOX双酶共表达,从而达到在低聚果糖合成过程中同步解除反应副产物葡萄糖的抑制效应的效果,进一步利用该启动子表达GOX蛋白,转化株FGX55的葡萄糖氧化酶活力达120U/g,应用转化株合成低聚果糖发现,产物中葡萄糖含量较出发菌株减少32%,低聚果糖含量得到提高,达到70%。同时,为减少动物饲料用低聚果糖的生产成本,本文成功在废糖蜜生境中筛选出一株低聚果糖合成能力的丝状真菌,经形态学鉴定和ITS序列的系统发育进化树分析可知此菌为塔滨曲霉XG21;该菌株对葡萄糖、果糖、木糖、甘油、蔗糖、麦芽糖均能利用,但在甘油为碳源时生长较慢;上述碳源中,该菌株生产β-呋喃果糖苷酶受蔗糖诱导,且48小时酶活最高,为280 U/g;低浓度蔗糖环境时,该菌株表现水解活力,产物以葡萄糖和果糖为主,高蔗糖浓度时,果糖基转移酶活性增强,FOS不断产生,反应平衡时FOS浓度约为56%;利用甘蔗糖蜜为碳源进行菌株产酶优化,当甘蔗糖蜜浓度为20%(相当于8%蔗糖)时,菌株酶活为580 U/g,比8%蔗糖发酵时提升近一倍。