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脂肽类化合物具有抗菌谱广、活性稳定、不易产生耐药性等优点,在食品、饲料、农业、医药领域具有广阔的应用前景。传统的产脂肽类微生物的筛选方法限于化学筛选、活性筛选或者二者结合筛选,常常导致已知化合物的重复发现,而且无法准确预测化合物的类型,耗时费力。随着分子生物信息学的快速发展,许多微生物次级代谢产物的全基因组序列和生物合成机制得到解析,以非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPSs)基因的保守功能域为探针,PCR扩增目的片段,通过系统发育分析可以预测化合物的类型,这种方法目标直接指向脂肽类化合物的合成基因簇,为研究和开发脂肽类天然产物提供了新的理论依据。本研究以葡萄为研究对象,筛选分离其表面的附生细菌,在此基础上,以NRPSs基因A结构域保守序列为探针,PCR扩增筛选获得含有NRPSs的菌株,通过生物信息学分析获得合成环脂肽surfactin的生物合成基因簇,构建基因簇捕获载体,结合转化介导重组(Transformation-associated recombination,TAR)、基因编辑CRISPR/Cas9和Gibson组装技术及其组合,实现对surfactin生物合成基因簇的异源表达。1.基于NRPSs筛选产环脂肽化合物的菌株。采用稀释梯度法和平板划线技术,从夏黑葡萄中筛选分离到5株附生细菌:PTWA1～5。采用生理生化实验与分子生物学鉴定相结合的方法,5株细菌分别鉴定为Bacillus methylotrophic Bacillus subtilis、Bacillus rhizosphaerae、Kocuria marina、Pseudomonas jessenii,以 NRPSs 功能基因为靶点,定向筛选到一株能够合成环脂肽Surfactin的附生细菌及subtilis。2.构建特异性捕获Surfactin基因簇的穿梭载体。以质粒pLLX13为骨架、以源于pLLX8质粒的bla/CYH2片段为筛选标记、以B.subtilis基因组DNA为模板PCR扩增Surfactin生物合成基因簇上下游同源臂,利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CRY1-2)高效的同源重组机制构建Surfactin生物合成基因簇的酵母捕获载体(Yeast capture vector,YCV)。3.利用3种不同组合克隆方法异源表达Surfactin生物合成基因簇:1)限制性酶切+TAR;2)CRISPR/Cas9+TAR;3)CRISPR/Cas9+Gibson,将 Surfactin 生物合成基因簇重组到载体YCV中,形成重组质粒YCV-srf。以大肠杆菌BL21为表达宿主,导入重组质粒,琼脂糖凝胶电泳验证获得阳性克隆子,得到Surfactin基因簇的表达菌株BL21/YCV-srf,IPTG诱导表达转化重组子,有机溶剂萃取转化子发酵液,得到发酵提取物,进一步结合薄层层析(thin layer chromatography,TLC)、高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)和电喷雾质谱(electrospray mass spectrometry,ESI-MS)等手段对发酵产物进行检测分析,推测可能产生化合物Surfactin对重组克隆子进行大量发酵,发酵产物经溶剂萃取、柱层析分离纯化得到单体化合物,通过核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)鉴定其化学结构为:C15-Surfactin,结果表明Surfactin生物合成基因簇在大肠杆菌中成功表达。该研究构建了捕获Surfactin生物合成基因簇的重组载体,并采用3种不同组合的克隆方法对Surfactin生物合成基因簇进行异源表达,为DNA片段的定向克隆提供了理论依据和技术支撑。