驱虫斑鸠菊的质量控制与酪氨酸酶配体的快速筛选

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第一部分:不同提取方式对驱虫斑鸠菊生物活性及化学特征的影响目的:比较不同提取方式对驱虫斑鸠菊生物活性及化学特征的影响。方法:选取新型的提取方法包括快速溶剂提取(ASE)、超声提取(UAE)、组织破碎提取(TSE)及传统的提取方法包括浸渍提取(ME)、索氏提取(SE)共5种提取方法对驱虫斑鸠菊中的活性成分进行提取。以总酚含量(TPC)、总黄酮含量(TFC)、抗氧化活性(DPPH,ABTS,FRAP,CUPRAC,总抗氧化能力及总还原能力)及酶活性(酪氨酸酶及α-葡萄糖苷酶)作为评价指标,通过方差分析、PCA分析及聚类分析对不同提取液进行了比较。最后采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-Orbitrap-MS)对提取液中的主要化学成分进行了鉴定。结果:不同的提取方法可通过聚类分析分为两类,其中ASE及UAE具有较高的提取效率;自由基抗氧化活性与总酚含量具有较高相关性;驱虫斑鸠菊对酪氨酸酶具有激活作用,对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。通过UPLC-Orbitrap-MS分析,鉴定了驱虫斑鸠菊提取液中的24种化学成分,主要为黄酮类及酚酸类。结论:不同提取方式对生物活性具有较大影响,其中通过ASE等新型提取技术获得的驱虫斑鸠菊提取物生物活性较强,实验结果可为进一步研究提供提取方式的参考。第二部分:HPLC-ESI-MS/MS法同时测定驱虫斑鸠菊中13种成分目的:建立一种简便、快速可同时对驱虫斑鸠菊中13种成分(异鼠李素、咖啡酸、木犀草素、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、槲皮素、芦丁、紫铆查尔酮、圣草酚、野黄芩素和芹菜素)进行定量分析的HPLC-ESI-MS/MS方法。方法:色谱条件:色谱柱:XSelect HSS T3(4.6×150 mm,3.5μm),流动相:0.05%三氟乙酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱,流速为1 mL/min,分析时间:23 min,柱温:30℃。质谱条件:ESI源,离子源温度(TEM):500℃,采用多反应离子监测(MRM),负离子模式扫描。源喷射电压(IS):-4500 V,雾化温度:500℃,雾化气(GS1):50 psi,辅助气(GS2):50 psi。接口持续加热,全程氮气通入状态。结果:13种活性成分在测定浓度范围内线性关系良好(r~2≥0.9944),精密度、准确度、检测限及定量限均符合要求。结论:所建立的方法简便、迅速,可用于驱虫斑鸠菊中13种化学成分的含量测定。第三部分:离线二维液-质联用与分子对接技术快速筛选驱虫斑鸠菊中酪氨酸酶配体目的:建立一种快速、简单、高效筛选驱虫斑鸠菊提取液中酪氨酸酶配体的方法。方法:采用离线二维高效液相色谱-质谱联用技术,对驱虫斑鸠菊提取液中的酪氨酸酶配体进行筛选和鉴定,并使用体外活性测定及分子对接技术对筛选结果进行验证。首先将驱虫斑鸠菊提取液与酪氨酸酶一起孵育,然后使用HLB色谱柱收集酶-配体复合物,再使用解离液将结合物解离,使用HPLC-MS分析解离液对结合配体进行筛选。结果:筛选到7种潜在的酪氨酸酶配体,活性分析表明,其中5种化学成分包括圣草酚、紫铆查尔铜、绿原酸、异绿原酸B及异绿原酸C具有酪氨酸酶激活活性,2种成分异鼠李素及木犀草素具有酪氨酸酶抑制活性,最后通过分子对接技术进一步验证了它们与酶的结合模式。结论:离线二维液质联用技术为中药活性成分的快速筛选提供了有效的方法。
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