本论文研究了天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)基因组DNA中抗生素代谢途径专一调控基因、双组分信号传导基因及A因子调节体系关联基因对十一烷基灵菌红素(Red)与放线菌紫素(Act)生物合成的影响；分析了这些基因对抗生素次生代谢过程的调控作用，通过将调控基因和萤光蛋白基因融合表达，观察了基因的时空表达模式。同时，还成功地建立了三片段DNA和载体质粒一次性连接的4-way ligation技术并分析讨论了影响连接的主要因素，考察了同源双交换基因敲除进行基因定位突变的影响因素，建立了有效的突变株筛选方法。 根据天蓝链霉菌基因组DNA中抗生素十一烷基灵菌红素(Red)与放线菌紫素(Act)生物合成途径专一调控基因分别是actⅡ-orf4和redD的报道，以整合型质粒pSET1152为载体，将外源actⅡ-orf4和redD基因插入到天蓝链霉菌的基因组DNA上，分别获得了含双拷贝actⅡ-orf4和redD的基因突变株lyqAG1521和lyqRY1522。基因突变株的发酵动力学研究表明，lyqAG1521合成Act及lyqRY1522合成Red的能力分别提高了约40％，证实了actⅡ-orf4和redD拷贝数的增加有利于抗生素的生物合成，说明它们属于正调控基因。 采用同源双交换技术分别敲除了天蓝链霉菌染色体DNA中两组双组分信号转导基因ecrA1／ecrA2和ecrE／ecrF，获得了四个基因突变株lyqA2001、lyqA2002、lyqE2003和lyqF2004。发酵动力学试验表明，四个基因突变株合成抗生素Red的能力显著降低，而Act的生物合成水平只是略有降低，说明ecrA1／ecrA2和ecrE／ecrF对Red生物合成起强正调控作用，而对Act的生物合成只起到弱正调控作用。 A因子SCB1是天蓝链霉菌中的γ-丁内酯类化合物，SCB1的生物合成与scbR和scbA两个基因有关，scbA是A因子合成酶基因、scbR编码A因子的结合蛋白。采用同源双交换技术分别敲除了scbR和scbA基因，筛选得到了基因敲除突变株lyqSR2005(scbR)和lyqSA2006(scbA)。发酵动力学试验表明，lyqSA2006合成Red和Act的能力比对照株M145提高了8倍；而lyqSR2005合成这两种抗生素时间延后，产量却不如对照组。由于scbA基因敲除突变株不能合成产γ-丁内酯类化合物，而scbR基因敲除突变株不产A因子的结合蛋白，说明A因子对这 浙江大学博士学位论文两种抗生素的生物合成起强负调控作用，而A因子的结合蛋白的则有较弱的正调控作用。卜述研究表明，山S动乃尸及胡组成的A因子自我调节体系对抗生素次生代谢调二竹起着重要作用，是抗生素生物合成的开关基因。 应用激光共聚焦扫描显微镜及荧光蛋白基因融合技术观测了细胞生长过程中调节基因的时空表达规律。将Red与ACt生物合成途径专一调控基因二“/I一。厂辉和一l厂。必分别和荧光蛋白基因塔幼、已厂斥，融合成:。汀/--oI辉::明动和厂。跳:。，动，通过整合质粒整合到天蓝链霉菌的染色体DNA上。在S)1M液体培养基中的时间表达模式表明，二。必和a“jl侧刀d厂尹这两个基因是在菌体对数生长期到一平缓期的过渡期开始表达，而在平缓期大量表达;固体培养基中的空间表达模式表明，厂。朋和actll，厂脚的基因只在成熟的基内菌丝中表达，气生菌丝内不一表达。类似地，将A因子合成酶基因sc浏和编码A因子的结合蛋白基因、解与荧光蛋白基因融合，分别获得了含融合基因即动::sc解一sc胡::、巾的突变株并进行了时空表达研究，结果表明，液体培养时Lgc浏和scb刀是在菌体对数生长期和对数生长期和平稳期间的过渡期表达的，而在平稳期结束表达;固体培养基中的空间表达模式表明，夕cb尸和、bA基因与二。必和actll一‘，z，甲同样只在成熟的基内菌丝中表达，气生菌丝内不表达。这些抗生素调节基因的表达与间歇发酵时抗生素的合成曲线基本一致。