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胃癌及肝癌已成为威胁人们健康的两大杀手。目前临床上治疗的癌症大多已经是到了晚期,现有的治疗方法对完全治愈癌症效果不好,所以对癌症的早期诊断可能是取得较好治疗效果的关键。本研究以胃癌和肝癌细胞为靶标,运用细胞-SELEX(cell-SELEX)技术筛选出可特异性靶向胃癌和肝癌细胞的核酸适配子,然后初步研究这些适配子进行临床诊断的可能性,目的在于利用适配子建立起基于胃癌和肝癌细胞表面分子的分析技术以及为癌细胞适配子的应用于临床诊断打下基础。胃癌细胞适配子的筛选：以SGC7901胃癌细胞为靶细胞,GES-1胃黏膜细胞为反筛细胞,利用cell-SELEX技术,优化筛选条件后经过10轮的筛选,对结合力最高的第8轮的文库进行克隆、测序得到7条适配子。通过DNAMAN软件对这7条适配子的结构进行分析,截短部分序列,得到16条截短后的适配子,适配子具有不同的二级结构,但大部分都具有loop-stem结构的结构。流式细胞仪测定各适配子的结合力都在纳摩尔水平,其中序列截短后的适配子的结合力均要比原长(78nt)要高。适配子Sla的结合力(Kd=141.6nM)大约是S1(Kd=441.7nM)的4倍；S2a的结合力(Kd=261.2nM)大约是S2(Kd=566.9nM)的2倍；所筛选的适配子中S4a的结合力最高,约为59.71nM,其余各适配子的结合力都不是很好。荧光显微镜下观察到：适配子Sla、S1b、S2a和PS4a都能很好地与SGC7901胃癌细胞结合,发出很强的荧光,然而与GES-1胃黏膜细胞基本没有结合。更重要的是,所筛选的适配子与其它非靶细胞,如：97L肝癌细胞、HT29结肠腺癌细胞、A498人肾癌细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞都没有作用,说明了筛选的适配子对靶胃癌细胞具有很强的特异性。SGC7901胃癌细胞经胰酶或蛋白酶K处理后,不能再与适配子很好地结合,初步说明适配子有可能是与细胞表面的膜蛋白或是与膜蛋白紧密连接的分子结合。最后初步研究了胃癌细胞适配子的临床应用：①组织染色：适配子Sla、Slb、S2a和S4a都能很好地与人的胃癌组织结合,发出很强的荧光,而与人的正常胃组织基本没有结合。②俘获和释放癌细胞：适配子-磁纳米颗粒可以很好地吸附SGC7901胃癌细胞,细胞计数得到俘获效率大约为93%；而此适配子-磁纳米颗粒吸附不到7%的GES-1胃黏膜细胞。通过酶处理适配子-磁纳米颗粒的细胞簇,适配子被降解,所吸附细胞的释放效率与酶的处理时间相关,当处理40min时,对细胞的释放效率可达80%,此结果为适配子应用于循环肿瘤细胞的检测提供了可能；③适配子荧光探针体外检测癌细胞：适配子荧光探针在没有靶细胞存在的情况下,其荧光基本是淬灭的,但当与靶细胞孵育后,荧光会得到很大的恢复。用此适配子荧光探针可以检测30,000到300个靶细胞,当靶细胞的量只有300个时,此时适配子荧光探针也会有荧光响应；④适配子荧光探针体内检测癌细胞：适配子荧光探针在老鼠体内会随着血液循环进入全身各处,15min内在肿瘤的部位有明显的富集,发出很强的荧光,初步说明适配子有可能用于肿瘤成像。肝癌适配子的筛选：以Huh7.5.1肝癌细胞为靶细胞,HeLa人宫颈癌细胞作为反筛细胞,利用cell-SELEX技术,经过13轮的筛选,对结合力最高的第13轮的文库进行克隆、测序得到7条适配子。通过DNAMAN软件对这7条适配子的结构进行分析,对各适配子的序列及长度进行优化,共得到19条截短的序列。适配子具有不同的二级结构,但大部分都具有loop-stem结构的结构。流式细胞仪测定所有适配子的结合力,适配子与肝癌细胞的结合力都在纳摩尔水平,且都对肝癌细胞具有良好的特异性。其中适配子H4a和H4b的结合力最好(H4a, Kd=22.92nM; H4b, Kd=8.496nM),适配子H1c和H1d的结合力居中(Hlc,Kd=59.99nM; H1d, Kd=62.11nM),适配子H7a的结合力最差,解离常数为116.1nM,其余各条序列的结合力都在88nM-30nM之间。荧光显微镜下观察到：适配子H2a、H2b、U2c、H3a、H3b和H4a都能很好地与Huh7.5.1肝癌细胞结合,发出很强的荧光,然而与ieLa人宫颈癌细胞基本没有结合。更重要的是,流式细胞术实验显示,所筛选的适配子与HepG2肝癌细胞有着与Huh7.5.1肝癌细胞相近的结合率。所筛选的适配子与其它非靶细胞,如：97L肝癌细胞、LM9肝癌细胞、HT29人结肠腺癌细胞基本没有作用,与GES-1胃黏膜细胞与适配子的结合率均在30%左右,Hs578Bst人乳腺上皮细胞与适配子有很强的结合(50%-70%)。只有适配子H1c和Hld显示出最高的特异性,对L-02人正常肝细胞的结合力在15%左右,对Huh7.5.1肝癌细胞和HepG2肝癌细胞结合力大于80%。然后初步研究了肝癌适配子与临床组织样本的结合情况,适配子H1bH1c、 H2a、H2b、H2c和H3a都能很好地与人的肝癌组织结合,发出很强的荧光,而与人的正常肝组织有微弱的结合,但二者之间的差别还是很明显的。最后为了更好地提高适配子与靶肝癌细胞的结合力,我们对核酸适配体序列H1a的碱基进行异胸苷酸(D-/L-IsoT)的胸苷酸位点的修饰合成,得到10条修饰后的序列,紫外测定修饰后的序列与Huh7.5.1肝癌细胞以及L-02人正常肝细胞的结合情况,结果得到：DT-2-22TD、DT-2-36TL、DT-2-32TL这3条序列的结合力比原序列要高,而且基本不与L-02人正常肝细胞的结合。