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营养可通过调控雌二醇、孕酮等激素的水平影响后备母猪的繁殖性能。在转录水平或翻译水平上调控雌二醇合成的限速酶芳香化酶及孕酮受体对雌二醇的合成分泌和孕酮功能的发挥具有重要作用。Micro-RNAs (miRNAs)是一种21～25nt长度的单链小分子RNA,在基因表达的转录后水平调控发挥着重要功能。研究发现miR-378在牛卵巢的黄体退化过程存在表达,生物信息学预测发现miR-378在猪芳香化酶、孕酮受体3’端非翻译区(3’UTR)上存在靶定位点,可能影响芳香化酶和孕酮受体的表达。因此,本研究考察了营养水平对后备母猪卵巢miR-378表达的影响,并通过体外培养后备母猪卵巢颗粒细胞研究了miR-378的功能和作用机制。本研究包括以下四部分：试验一营养水平对后备母猪卵巢miR-378表达的影响本试验通过不同营养水平(采食水平)饲喂正常发情一次后的后备母猪,研究营养水平对后备母猪卵巢miR-378表达的影响。8头LY(Landrace×York)后备母猪第一次发情后,随机分为两个处理,每个处理4个重复,每个重复1头猪,按正常采食水平(2.5kg/d)和过度限饲(0.5kg/d)分别饲喂。后备母猪第三个情期时屠宰取样。试验结果表明不同营养水平显著(P<0.05)影响后备母猪发情率,过度限饲组母猪出现全部不发情现象。营养水平影响后备母猪卵巢miR-378的表达水平,正常营养水平组显著(P<0.05)低于过度限饲组。正常水平组大、小卵泡的颗粒细胞均表达miR-378,且大卵泡颗粒细胞的表达量显著(P<0.05)低于小卵泡颗粒细胞,说明miR-378在卵泡发育过程中可能有重要作用。试验二慢病毒介导的miR-378对猪颗粒细胞的影响试验一发现营养水平显著影响卵巢miR-378的表达,同时也影响了后备母猪的繁殖性能,结合生物信息学预测结果miR-378在多种与繁殖相关基因的3’UTR上存在靶定位点,推测营养对繁殖性能影响的途径之一可能是通过miR-378而实现。为此本试验拟通过慢病毒转导的方式将miR-378导入颗粒细胞,研究miR-378对颗粒细胞功能的影响。试验通过TA克隆并酶切获得H1-miR-378片段,片段与含相同酶切位点的骨架质粒连接获得目的质粒pL-SIN-Lenti-H1-miR-378-EF1α-GFP。随后分别应用脂质体转染和磷酸钙共沉淀法转染HEK293FT细胞制备miR-378慢病毒,并选取合理的方法批量生产病毒。体外原代培养大、小卵泡的颗粒细胞,当细胞生长汇合达40-50%时转导miR-378慢病毒,使miR-378在颗粒细胞中过量表达,研究miR-378对颗粒细胞增殖、抗凋亡、基因表达、蛋白表达和雌二醇分泌的影响。试验结果表明：1.试验成功构建了用于包装慢病毒的miR-378质粒pL-SIN-Lenti-H1-miR-378-EF1α-GFP。2.脂质体转染和磷酸钙共沉淀法转染均成功制备了miR-378慢病毒。分离培养后备母猪卵巢颗粒细胞,转导两种方法制备的慢病毒,发现转导效率相当,且磷酸钙共沉淀法实验成本低于脂质体转染法,因而确定批量生产miR-378慢病毒采用磷酸钙共沉淀法。3.转导miR-378慢病毒后,miR-378的表达量显著(P<0.05)高于对照组,达到过量表达miR-378的目的。过表达miR-378促进颗粒细胞的增殖和抗凋亡能力。miR-378在转录水平上对C-kit,Ret,GDNF,aromatase,FSHR,GFRa-1, MAPK, Star, LHR, PGR, Bmi-1和Cx43基因的表达差异均未达显著水平(P>0.05),却显著抑制(P<0.05)了PGR和a(?)romatase蛋白的合成,说明miR-378在转录后水平或翻译水平对PGR和(?)aromatase起着调控作用；试验同时研究了miR-378对FSHR、GDNF、和MAPK蛋白表达的影响,但差异均未达显著水平(P>0.05)；过表达miR-378抑制(P<0.05)颗粒细胞雌二醇的分泌。试验三miR-378调控芳香化酶、孕酮受体表达的分子机制生物信息学预测发现miR-378在aromatase, FSHR, c-Kit, MAPK和(?)PGR3’UTR上存在靶定位点,试验二在细胞水平上发现miR-378影响axomatase和PGR蛋白的表达,miR-378对这两种蛋白的抑制作用是否因为靶定了其3’UTR,为此开展了试验三的研究。本试验首先克隆PGR和(?)aromatase3’UTR及miR-378靶定位点突变的3’UTR进入荧光素酶报告基团质粒。随后体外培养大卵泡颗粒细胞,细胞达40～50%汇合时,转导miR-378病毒,24h后分别瞬时转染3’UTR及突变的3’UTR荧光素酶报告基团质粒和内参质粒,从正反两方面研究miR-378是否通过靶定PGR和(?)aromatase3’UTR而影响荧光素酶的表达。试验结果表明：1.试验成功构建了PGR和(?)aromatase3’UTR的荧光素酶报告基团质粒：p-miR-Report+WT miR-378BS in PGR3’UTR, p-miR-Report+WT miR-378BS in PGRb3’UTR, p-miR-Report+WT miR-378BS in aromatase3’UTR, p-miR-Report+conUTR以及PGR和aromatase3’UTR特定位点突变的荧光素酶报告基团质粒:p-miR-Report+MU miR-378BS in PGRb3’UTR, p-miR-Report+MUA miR-378BS in aromatase3’UTR, p-miR-Report+MUB miR-378BS in aromatase3’UTR和p-miR-Report+MUC miR-378BS in aromatase3’UTR。2. PGR3’UTR显著(P<0.05)降低了荧光素酶的活力,靶定位点突变后荧光素酶的活力较未突变组显著(P<0.05)升高,并与对照组无差异(P>0.05),由此说明PGR3’UTR上的预测位点+4062-+4082即为miR-378的靶定位点；aromatase3’UTR也显著降(P<0.05)低了荧光素酶的活力,miR-378在aromatase3’UTR存在三个靶定位点,分别突变这三个位点,发现突变位点A和B突变后荧光素酶的活力较未突变组显著(P<0.05)升高,并与对照组无差异(P>0.05),而突变位点C仍然降低(P<0.05)荧光素酶的活力,说明预测位点A(+1589+1609)和B(+1607-+1627)是(?)niR-378发挥作用的靶定位点,而位点C(+1627-+1647)则不发挥作用。由此表明miR-378通过靶定结合aromatase和(?)PGR mRNA的3’UTR+1589-+1609,+1607-+1627和+4062-+4082位点在转录后水平发挥调控作用。阐明了miR-378抑制(?)aromatase和PGR蛋白表达的机制。试验四过表达aromatase3’UTR及miR-378抑制剂对颗粒细胞的影响雌二醇是后备母猪初情启动卵巢卵母细胞发育的关键激素,芳香化酶是颗粒细胞内合成雌二醇的关键酶,为了进一步明确miR-378对芳香化酶表达和雌二醇分泌的影响,开展了试验四的研究。本试验首先构建了过表达aromatase3’UTR的质粒。颗粒细胞转导miR-378慢病毒后转染aromatase3’UTR过表达质粒,转染该质粒后颗粒细胞过量表达aromatase3’UTR,这类aromatase3’UTR可竞争性耗竭颗粒细胞内过表达的miR-378,逆转miR-378与内源aromatase3’UTR靶定结合引起的aromatase表达降低现象。本试验同时还研究了miR-378抑制剂对大、小卵泡颗粒细胞内源miR-378表达的影响；转导miR-378(?)病毒同时转染miR-378抑制剂研究miR-378抑制剂对颗粒细胞芳香化酶蛋白表达和雌激素分泌的影响；转导miR-378病毒同时转染miR-378抑制剂和aromatase3’UTR荧光素酶报告基团质粒,研究miR-378抑制剂对miR-378引起的aromatase3’UTR荧光素酶活力降低的影响。试验结果表明：1.试验成功构建了过表达aromatase3’UTR的质粒CMV-Aro-3’UTR以及对照组质粒CMV-con-3’UTR。2.转染过表达aromatase3’UTR质粒后,aro-3’UTR的表达显著(P<0.05)高于miR-378组和UTR对照组,达到过量表达aro-3’UTR的目的。3.颗粒细胞转导miR-378病毒后转染aromatase3’UTR,发现aromatase3’UTR显著(P<0.05)逆转了miR-378导致的颗粒细胞aromatase蛋白表达和雌二醇分泌的抑制作用。4.转染miR-378抑制剂于未转导miR-378病毒的颗粒细胞中,发现miR-378抑制剂显著(P<0.05)抑制颗粒细胞内源miR-378的表达。5.颗粒细胞转导miR-378病毒后转染miR-378抑制剂,发现miR-378抑制剂显著(P<0.05)逆转了miR-378抑制颗粒细胞aromatase蛋白表达和雌二醇的分泌。6.颗粒细胞转导miR-378病毒后转染miR-378抑制剂和aromatase3’UTR荧光素酶报告基团质粒,发现miR-378抑制剂逆转了(P<0.05)miR-378导致的aromatase3’UTR荧光素酶活力降低的现象。综上所述,营养水平显著影响后备母猪卵巢miR-378的表达,限制营养水平下miR-378的表达显著高于正常营养水平。miR-378通过靶定结合PGR3’UTR+4062-+4082和(?)aromatase3’UTR+1589-+1609和+1607-+1627位点,在转录后水平上调控这两种蛋白的表达,阐明了miR-378在猪卵巢颗粒细胞中的作用机制。Aromatase是雌二醇合成关键酶,aromatase蛋白水平的变化直接影响着雌二醇的合成,雌二醇是影响繁殖内分泌的重要激素,由此阐明了营养影响卵巢miR-378的表达是实现营养调控繁殖内分泌的途径之一。