本研究以黄河鲤为实验材料,选择220条10bp的随机引物、10对SSR引物及100条ISSR引物,利用RAPD-PCR、SSR-PCR及ISSR-PCR三种分子标记技术对黄河鲤基因组进行扫描,试图发现一些与黄河鲤性别相关的连锁标记。SSR结果显示,虽然在对其DNA池进行扫描的过程中,在1对引物的扩增谱带上发现了1条可能与性别连锁的疑似条带,但当利用这对引物在更多的个体中验证时,没有发现其性别特异性;而ISSR结果表明,在所有筛选出来的10条引物的扩增谱带上,未发现与性别连锁的疑似条带。利用RAPD技术对黄河鲤雌、雄基因池进行扫描的结果表明,其中的5条随机引物的扩增谱带中有疑似性别特异条带的存在,利用这5条随机引物在个体中进行反复验证,只有随机引物S2107的扩增产物中存在一条稳定的雄性特异条带。经回收、克隆、测序后获得了一条大小为909bp的候选雄性特异条带,命名为Ccmf1。BLAST检索发现该片段与位于斑马鱼连锁群1的一段重复序列(DKEY-24 H 22)有一定的相似性。此外,本研究还利用抑制性消减杂交技术,成功构建了黄河鲤鱼基因组DNA的消减文库,随机挑选150个克隆经巢式引物PCR验证后,获得88个阳性克隆,以正、反向二次PCR产物为探针,与88个阳性克隆质粒DNA进行Southern dot blotting杂交,从中挑选了22个候选性别特异阳性克隆进行序列测定,经特异引物的PCR验证后,获得了两个长度分别为387bp和183bp雄性特异的DNA片段,BLASTN和BLASTX检索未发现与其同源的核苷酸和氨基酸序列,将其命名为Ccmf2和Ccmf3。根据3个雄性特异片段的序列分别设计特异引物,以管家基因GAPDH为内部对照,雌雄个体基因组为模板进行特异PCR扩增。结果表明,在所有的雄性个体中均扩增出了稳定的目的特异性条带,而雌性个体中没有该条带的出现。由于分离到的三个片段都与雄性性别连锁,所以推测黄河鲤的染色体类型应该为XX/XY型。为了进一步了解三个片段的性别特异性,利用特异PCR技术对100个黄河鲤的雌、雄基因组进行了验证,结果发现,Ccmf1和Ccmf2的性别特异性分别为99%和98%;Ccmf3的性别特异性达到了100%,故3个雄性特异片段在两染色体(性染色体和常染色体)间的重组值都很低,可以用于黄河鲤的遗传性别的鉴别。分别以Ccmf1、Ccmf2和Ccmf3为探针,与鲤鱼的其他三个品种:野生黄河鲤、建鲤以及丰鲤的基因组进行斑点印迹杂交(雌、雄各5尾),以期判断这3个性别特异片段的分子性别有效性(即雌雄鉴别的效率)。结果发现,在雌性个体中,Ccmf1、Ccmf2和Ccmf3的分子性别有效性分别为67%,80%和93%;而在雄性个体中,其分子性别有效性分别为67%,100%,和73%。充分说明在鲤鱼不同种间性染色体的分子类型的多样性。3个雄性连锁标记的发现与鉴定,能够作为鉴别黄河鲤遗传性别以及识别该鱼种性染色体的分子切入点,从而为探讨该物种性别决定及分化机制提供依据。为了更加全面的了解黄河鲤性腺发育机制,本研究还从mRNA水平上,分别以精巢与卵巢互为验证方,成功构建了黄河鲤成熟期雌、雄性腺的双向差减文库,经菌液PCR对文库进行初步筛选,分别获得了280个(来自雄性文库)和240个(来自雌性文库)含有插入片段的阳性克隆;然后利用Southern dot bltting对随机挑选的180个克隆(雌、雄各90个)在正、反杂交膜上进行了鉴定,从中找到了64个(其中来自雄性文库21个,雌性文库43个)候选差异表达克隆,经序列测定后,通过BLASTN和BLASTX对这些候选差异基因片段进行功能分类,得到了50个ESTS序列。其中雄性文库的18个差异ESTS中,包括14个已知功能的和4个未知功能的基因片段。按照其功能,14个ESTS分属于结构蛋白基因、蛋白质翻译机制相关基因、离子通道和蛋白转运基因、肿瘤相关和肿瘤抑制因子及其他基因等;而来自雌性文库的32个差异ESTS代表了27个已知功能基因和5个未知功能的基因,在已知功能基因中,出现频率较高的是来自呼吸链上的相关基因片段,以及与蛋白合成有关的基因片段;除一些未知功能蛋白外,其他的则出现了1次。参照斑马鱼及其他脊椎动物基因功能分析,雌性文库中已知功能EST分属调节因子、结构蛋白、酶类、转录因子、信号调控等。根据部分同源基因在黄河鲤精、卵巢中的半定量表达情况,在雄性差异文库中找到10个差异表达基因片段:5个为精巢特异表达基因;5个为精巢高效表达基因;其中包括2个首次发现的未知功能基因。在雌性差异文库中找到8个差异表达基因片段:2个为卵巢特异表达基因;6个为卵巢高效表达基因,其中包括1个未知功能基因。根据各基因片段的性质及编码功能,选择了可能参与性腺发育的3个基因片段,利用RACE技术对其全长进行了扩增,分别获得了大小为2173bp、1763bp以及884bp的全长基因,他们分别是Hmwt1a基因、HmSetd6基因以及HmPsmb2基因。最后,通过在成体不同组织的半定量和荧光定量表达模式分析,发现这3个基因均为性腺差异表达基因,其中Hmwt1a基因主要在精巢中表达,HmSetd6基因则主要在卵巢中表达,且表达量远远高于精巢,而HmPsmb2基因则是卵巢特异表达基因;通过与脊椎动物性腺发育相关基因功能的对比,推测Hmwt1a基因可能是黄河鲤雄性性别发育的重要调控基因;Hmsetd6基因则作为表观调控基因参与了黄河鲤雌性性状的发育;而HmPsmb2基因是在生理上或行为上维持黄河鲤雌性性别的性别偏向基因;这些基因的发现及相关性腺差异表达EST文库的构建,将对了解黄河鲤性腺发育及性别分化的分子机制奠定基础,同时为黄河鲤性别控制机制的研究提供丰富的基因鉴定资源。