能否及早且准确地诊断出奶牛的妊娠状况是奶牛养殖的关键。奶牛受精后19-20 d(day)胚胎开始着床,大约在42 d完成这个进程。胚胎着床后会产生一些物质,能通过循坏系统到达母体各种体液中。这样从母体体液中检测某些分子来诊断妊娠状态就有了可能。而且着床之后,胚胎与母体子宫获得了联系,变得更为稳定和安全,较少再发生流产。所以人工授精(Artificial Insemination,AI)后的20-42 d是奶牛早期诊断的最合适的时间段。在着床过程中,许多细胞因子起着重要的调控作用,这些细胞因子也是潜在的妊娠诊断标记物。妊娠相关糖蛋白(Pregnancy Associated Glycoproteins,PAGs)在偶蹄类动物的妊娠阶段血清中的成周期性的变化,尽管PAGs在功能上的研究还不是很明确,但作为早期妊娠诊断标记分子已有大量研究。本课题选择妊娠相关糖蛋白PAG1为标记分子,以期建立一种ELISA试剂盒。首先,依据PAG1氨基酸序列,选出一段GTPPQEFQVC合成多肽;并与KLH偶联用于动物免疫,与BSA偶联用户筛选单克隆细胞;并命名为2017-020-KLH和2017-020-BSA。免疫4只BALB/c雌性小鼠,眼眶采血测效价,选择效价最高的小鼠(效价为12800)。之后取该小鼠脾脏细胞与小鼠骨细胞瘤SP2/0细胞,采用PEG法进行融合。融合后的细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养;用ELISA方法分两次筛选阳性单克隆细胞,选出4株阳性单克隆细胞1、3、7、12号;对这几株单克隆细胞进行抗体亚型鉴定,显示分别为IgG、IgM、IgG、IgM;选择IgG的1、7号进行进一步扩繁,并对细胞培养上清用Western Blotting(WB)进行抗体特异性鉴定。分别用妊娠35 d以上的奶牛血清、HEK293细胞过表达PAG1和过表达PAG1加PNGase F去糖基酶进行WB。对特异性优良两株阳性杂交瘤细胞,注入小鼠腹腔,收集腹水,再从腹水中提取单克隆抗体,再进行纯化。之后,利用选取的单克隆抗体建立双抗夹心ELISA。经过条件选择后,采集奶牛血清AI 15 d后27份和AI 30 d后29份分别进行检测,与AI后2个月的B超监测结果对比,在AI 15 d后,阳性符合率为75%,阴性符合率为72.7%,总符合率为74.1%;AI 30d后,阳性符合率为91.3%,阴性符合率为83.3%,总符合率为89.7%。