基于二维光散射和荧光成像的单颗粒流式检测研究

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颗粒一般指尺寸在纳米至毫米之间具有特定形状的几何体。颗粒粒径、折射率和形状等参数是颗粒特征的重要表征,这些参数的检测是当前重要的研究方向。近期研究表明,与生物细胞及细胞分泌物相近的微米、亚微米和纳米尺度颗粒的精确测量,在生物医学领域具有重要意义。光散射技术作为一种无标记方法在单颗粒检测领域扮演重要角色。二维光散射可以同时反映光强度在方位角和极角两个方向上的分布,获取包括细胞亚结构等更丰富的信息。荧光显微成像技术空间分辨率高,可用来成像细胞中的特定分子。现有成像流式细胞仪较好地集成了荧光成像技术与明场成像,但缺乏二维光散射与荧光成像集成研究,特别是面向纳米颗粒的研究。本文围绕单颗粒光散射和荧光双模态流式检测进行了相关探索,主要工作如下:(1)集成了双物镜二维光散射与荧光成像流式系统,开展了流式状态下微米级荧光标记小球与普通小球的相关测量。单个流动的小球在532 nm激光的激发下,利用20X双物镜同时采集小球的二维光散射图样和荧光,通过二维光散射图样和荧光图像的逐帧对比,区分了不同种类的小球。(2)为了减轻光路调整与双模态图像匹配的难度,进一步研发了单物镜二维光散射与荧光成像流式系统,开展了微米级荧光标记小球与普通小球的相关测量。使用488 nm的激光束激发样本,10X物镜采集小球的二维光散射图样和荧光,并通过二向色镜将其分开由对应的CMOS传感器进行成像。通过二维光散射图样可区分不同尺寸的小球,结合荧光信息可识别尺寸相近的荧光小球与普通小球,实验获取的二维光散射图样的条纹数量及分布与模拟图样吻合,并可确定各种小球的数目及其比例关系。(3)开展了纳米颗粒的流式分析,使用100 nm荧光小球和120 nm普通小球作为混合样本,同时采集散射光和荧光,散射光和荧光图像在时间和空间上能够较好对应,可区分尺寸相似的百纳米级荧光小球与普通小球并计数。本文的研究结果表明,该集成装置可实现100 nm及以上尺寸荧光标记小球与普通小球的同时检测与识别,并可确定各小球的数量及其比例关系,预期可应用于单细胞以及外泌体检测等领域。
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