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研究目的:乙型肝炎是一种全球性的流行性传染病,是人类社会中重大的公共卫生问题。慢性乙型肝炎病毒（CHB）感染会导致肝损伤及肝功能异常,严重的会导致肝癌（HCC）的发生。尽管临床上有比较成熟的乙型肝炎病毒（HBV）预防性疫苗,预防健康人群感染HBV,但对于已经携带有HBV病毒的慢性乙肝患者,临床上一直缺少能彻底治愈的相关药物。HBV是导致乙肝的元凶,目前临床上使用干扰素类药物直接清除病毒,或通过核苷（酸）类似物（Nucleotide/Nucleoside analogues,NAs）抑制病毒复制两种方法治疗慢性HBV感染。然而这两种方法存在副作用大、易耐受等局限性,无法做到彻底治愈。慢性HBV感染之所以难以彻底治愈,主要是因为HBV有多种逃逸机体免疫系统监视的途径,如抑制DC细胞功能、引起T、B淋巴细胞功能异常等,这进一步导致了慢性HBV患者肝脏处于一种长期的免疫抑制的微环境中,很难彻底清除病毒。因此,改变HBV导致的免疫耐受状态,重新建立有效的抗病毒免疫状态是治疗慢性HBV最有前景的方法。治疗性疫苗是目前针对慢性HBV的一种有效的治疗策略。与传统的预防性疫苗相比,治疗性疫苗强调激活CD8+T细胞介导的细胞免疫应答,从而清除慢性乙肝患者体内的HBV,并形成免疫记忆防止HBV的再次感染。将HBV抗原与可以激活免疫系统的佐剂联用是构建HBV治疗性疫苗的重要途径,其中选择合适的佐剂成为了 HBV治疗性疫苗开发的重点之一。cGAS-STING通路是细胞中重要的信号转导途径,可调节Ⅰ型IFN及其它炎性细胞因子的水平。STING激动剂可以有效地活化免疫细胞,增强免疫应答,打破机体的免疫抑制微环境,从而起到抗肿瘤或抗病毒的作用,因此,STING激动剂具有作为疫苗佐剂的潜力。然而,小分子STING激动剂经外周注射进入体内后,会迅速分布到全身,难以有效进入激活免疫细胞的重要场所-淋巴结,甚至容易引起全身炎症反应,不利于其发挥佐剂的功效。纳米给药技术能将药物靶向递送至淋巴结,可以有效地解决这个问题。此外,通过使用纳米颗粒负载抗原和佐剂,也能促进DC细胞对抗原和佐剂的摄取,并增加了它们在DC细胞内的存留时间,可促进抗原呈递及免疫系统的激活。综上所述,在本研究中,我们使用一种阳离子聚合物胶束pAA-pEPEMA作为纳米载体,负载HBsAg与STIGN激动剂c-di-GMP,构建了一种新型的慢性HBV感染治疗性疫苗（简称“PP-SG”疫苗）,并分析了其理化性质,证明了该疫苗可以靶向淋巴结并增加抗原的递送。之后,我们对HBV-carrier小鼠,使用“初免-加强”（prime-boost）的免疫策略皮下给药,证明了“PP-SG”疫苗清除HBV、诱导anti-HBs产生的能力,以及防止HBV再次感染的能力。同时,我们也阐明了“PP-SG”疫苗对逆转免疫耐受、重新激活机体免疫应答的重要作用,为临床上彻底治愈慢性HBV感染提供了一种新的策略与思路。研究方法:1.使用尾静脉高压水动力注射的技术,向C57 BL/6J小鼠注射pAAV/HBV1.2质粒,以构建HBV-carrier小鼠模型。2.疫苗免疫策略为“初免-加强”,以一周时间为间隔,皮下免疫小鼠共3次。3.CLIA 法检测 HBV-carrier 小鼠血清 HBsAg。4.ELISA 法检测 HBV-carrier 小鼠血清 HBsAb。5.荧光定量PCR法检测HBV-carrier小鼠血清HBV DNA copies水平,及肝组织HBV相关DNA、RNA的表达。6.通过免疫组化法观察HBV-carrier小鼠肝组织中HBcAg的表达。7.HE染色观察HBV-carrier小鼠肝脏组织形态。8.赖式法检测HBV-carrier小鼠血清ALT的水平。9.再次向HBV-carrier小鼠注射pAAV/HBV1.2质粒,以观察疫苗防止HBV再次感染的能力。10.使用IL-4和GM-CSF体外诱导BMDCs。11.流式细胞术检测HBV-carrier小鼠肝脏、脾脏、淋巴结来源的DCs、CD8+T细胞、CD4+T细胞及其亚群胞内外相关分子的表达。研究结果:1.“PP-SG”疫苗的制备及理化性质纳米疫苗呈的球形,实际粒径在30-40 nm之间,水合粒径在130-150 nm之间。Zeta电位接近于0,疫苗呈电中性。2.“PP-SG”疫苗能靶向淋巴结并增加APCs对抗原的摄取与PBS及单独抗原相比,纳米疫苗能有效地提高抗原进入淋巴结的水平,增加淋巴结DC细胞和巨噬细胞对抗原的摄取。同时,体外用纳米疫苗处理BMDCs时,也能明显上调BMDCs中抗原的水平。3.“PP-SG”疫苗能促进BMDC的成熟与吞噬功能用“PP-SG”疫苗处理BMDCs,同时添加荧光分子FITC标记的BSA以观察其促进BMDC活化和吞噬的能力。与PBS相比,“PP-SG”疫苗处理BMDCs后,能显著提高BMDCs表面MHC-Ⅱ分子和CD86分子的表达,并且在与“SG”（游离HBsAg与游离c-di-GMP的物理混合物）或“PP-SG”（含HBsAg但不添加c-di-GMP的纳米疫苗）相比时显示出明显优势。同时,“PP-SG疫苗处理的BMDCs有更高的FITC的水平,表明其促进了 BMDCs对BSA的吞噬。4.“PP-SG”疫苗可以安全有效地清除HBV并防止HBV再次感染与PBS相比,“PP-SG”疫苗处理HBV-carrier小鼠后,显著降低了小鼠血清中HBsAg及 HBV DNA copies 的水平,下调了 肝组织 HBV DNA、HBV cccDNA、HBV-total-RNA、HBV-3.5kb-RNA及HBcAg的表达水平,并诱导了血清anti-HBs的表达。与“SG”和“PP-S”疫苗相比,“PP-SG”疫苗展现出最好的清除HBV的效果。此外,“PP-SG”疫苗处理后,小鼠血清ALT水平正常,肝组织切片也表现出正常的组织形态,表明“PP-SG”疫苗不会造成肝损伤。对治疗后的HBV-carrier小鼠再次注射pAAV/HBV1.2质粒时,经“PP-SG”疫苗治疗的小鼠表现出最低的血清HBsAg水平和最高的anti-HBs水平。5.“PP-SG”疫苗能增强HBV-carrier小鼠体内DC细胞的功能与PBS相比,“PP-SG”疫苗能有效下调HBV-carrier小鼠肝脏来源DC细胞及其亚群cDC1和cDC2表面PD-L1的表达,并在与“SG”和“PP-S”疫苗相比时展现出了优势。另一方面,“PP-SG”疫苗也能有效地上调DC细胞及其亚群cDC1和cDC2表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ以及共刺激分子CD86的表达,这个结果在肝脏和脾脏来源的DC细胞上均有体现。6.“PP-SG”疫苗能增加抗原特异性CD8+T细胞的比例并逆转其耗竭状态与PBS相比,“PP-SG”疫苗能上调HBV-carrier小鼠抗原特异性CD8+T的比例,并下调其表面PD-1、LAG-3和TIM-3等免疫抑制分子的水平,且与“SG”和“PP-S”疫苗相比,“PP-SG”疫苗的效果最优。7.“PP-SG”疫苗能促进CD8+T细胞增殖与活化并上调其抗病毒功能与PBS相比,“PP-SG”疫苗可以显著上调HBV-carrier小鼠脾脏来源的CD8+T细胞胞内Ki-67及表面共刺激分子ICOS的表达。同时,“PP-SG”疫苗也可促进肝脏来源的CD8+T细胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2及perforin等功能分子,该结果在淋巴结来源的CD8+T细胞上也有体现。与“SG”和“PP-S”疫苗相比,“PP-SG”疫苗表现出了更强的活化CD8+T细胞的效果。8.“PP-SG”疫苗能调节CD4+T细胞的功能与PBS相比,“PP-SG”疫苗可以有效下调HBV-carrier小鼠CD4+T细胞表面PD-1、LAG-3及TIM-3等免疫检查点的表达水平,并上调其胞内Ki-67及表面共刺激分子ICOS的表达。同时,“PP-SG”疫苗也可促进CD4+T细胞产生IFN-γ、TNF-α及IL-2等细胞因子。结论及意义:1.本研究证明,利用纳米载体将HBsAg与STING激动剂c-di-GMP联用设计的纳米疫苗“PP-SG”疫苗具有淋巴结靶向性,并可以延长抗原在淋巴结中的滞留时间,有利于刺激机体的免疫反应。2.本研究证明,“PP-SG”疫苗可以安全有效地清除HBV-carrier小鼠体内的HBV,并诱导出中和抗体,产生长效的免疫记忆,防止HBV再次感染。3.本研究证明,“PP-SG”疫苗可以改善HBV-carrier小鼠DC细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的功能,逆转免疫耐受现象,恢复耗竭T细胞的功能。4.本研究为临床上治愈CHB提供了一种新的策略与思路。