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DNA甲基化指在DNA甲基化转移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)参与作用下核苷酸对CpG二核苷酸的5-胞嘧啶变为5-甲基胞嘧啶的甲基化过程。DNMTs家族包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b。DNMT1是哺乳细胞细胞中含量最高的DNA甲基化转移酶，负责维持DNA甲基化水平。本文研究杆状病毒介导的DNMT1小干扰RNA(siRNA)干扰人胰腺癌细胞后的抗肿瘤作用的影响，进一步探讨以杆状病毒介导的RNA干扰作为胰腺癌治疗新靶点的机制。
本实验分三部分，分述如下:
一、DNMT1siRNA杆状病毒对人胰腺癌Patu8988细胞DNMT1的影响
目的:检测DNMT1siRNA杆状病毒对人胰腺癌PaTu8988细胞DNMT1表达及DNA甲基化酶活性的影响。
方法:DNMT1siRNA杆状病毒感染人胰腺癌PaTu8988细胞株。实验分组如下:空白对照组(C1组)、阴性对照组(C2组)、病毒r-Bac-si-DNMT1-D1组(D1组)、r-Bac-si-DNMT1-D2组(D2组)及r-Bac-si-DNMT1-D3组(D3组)。转染72小时后收集细胞，提取蛋白质。利用Western-blot法分别检测各组细胞DNMT1蛋白表达的变化，评价DNMT1siRNA干扰的沉默效率;利用DNMT酶活性试剂盒检测DNMT1siRNA瞬时转染对细胞DNMT酶活性的影响。
结果:Western-blot检测显示D1，D2，D3组DNMT1蛋白的表达低于空白对照组和阴性对照组;DNMT酶活性检测显示各病毒组DNMT酶抑制率显著高于其它各组(P＜0.05)。
结论:DNMT1siRNA杆状病毒能有效的抑制人胰腺癌细胞DNMT1蛋白的表达;DNMT1siRNA杆状病毒感染人胰腺癌PaTu8988细胞能显著的抑制DNMT酶的活性。
二、DNMT1siRNA杆状病毒对人胰腺癌Patu8988细胞增殖的影响
目的:研究DNMT1siRNA杆状病毒靶向沉默DNMT1基因对人胰腺癌细胞PaTu8988细胞的增殖和增殖相关蛋白(ProliferatingCellNuclearAntigen，PCNA)的表达。
方法:DNMT1siRNA杆状病毒感染人胰腺癌PaTu8988细胞株。实验分组如下:空白对照组（C1组）、阴性对照组(C2组)、病毒r-Bac-si-DNMT1-D1组(D1组)、r-Bac-si-DNMT1-D2组(D2组)及r-Bac-si-DNMT1-D3组(D3组)。转染72小时后收集细胞，利用MTT法测细胞增殖，利用Western-blot法分别检测各组细胞PCNA蛋白表达的变化。
结果:人胰腺癌PaTu8988细胞转染72h后，采用MTT法进行细胞增殖的检测。C1组细胞存活率为(100.00±6.00)％，C2组为(94.59±2.00)％，D1组、D2组和D3组细胞存活率分别为(43.90±6.80)％，(50.68±6.10)％，(43.24±4.10)％。与C1组和C2组相比，各病毒组的细胞存活率均显著降低(e＜0.05);C1组细胞存活率与C2组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。Western-blot检测显示各病毒组PCNA蛋白的表达低于C1和C2组。
结论:感染DNMT1siRNA杆状病毒后的人胰腺癌细胞PaTu8988细胞增殖被抑制;增殖相关基因PCNA蛋白表达降低。
三、DNMT1siRNA杆状病毒对人胰腺癌Patu8988细胞凋亡的影响
目的:研究DNMT1siRNA杆状病毒靶向沉默DNMT1基因对人胰腺癌细胞PaTu8988细胞凋亡和凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达。
方法:DNMT1siRNA杆状病毒感染人胰腺癌PaTu8988细胞株。实验分组如下:空白对照组(C1组)、阴性对照组(C2组)、病毒r-Bac-si-DNMT1-D1组(D1组)、r-Bac-si-DNMT1-D2组(D2组)及r-Bac-si-DNMT1-D3组(D3组)。转染72小时后收集细胞，利用AnnexinV-FITC/PI双染色法测细胞增殖，利用Western-blot法分别检测各组细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的变化。
结果:人胰腺癌PaTu8988细胞转染72h后，采用AnnexinV-FITC/PI双染色法进行细胞凋亡的检测。C1组细胞凋亡率为（1.19±0.03）％，C2组为（1.49±0.09）％，D1组、D2组和D3组细胞凋亡率分别为（5.09±0.17）％、（5.43±0.17）％、（5.75％±0.38）％。与C1组和C2组相比，各病毒组的凋亡细胞比例均显著增加(P＜0.05);C1组细胞凋亡率与C2组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。Western-blot检测显示各病毒组Bcl-2蛋白的表达低于C1和C2组，而Bax蛋白表达明显高于C1和C2组（P＜0.05）。
结论:感染DNMT1siRNA杆状病毒后的人胰腺癌细胞PaTu8988细胞凋亡增加;抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达降低，促凋亡基因Bax蛋白表达增加。