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背景和目的恶性肿瘤是目前威胁人类生命健康的一个重要的危险因素,食管癌是恶性肿瘤中的一个主要组成部分。目前食管癌(Esophageal carcinoma,EC)是世界第九大常见恶性肿瘤,也是与癌症相关死亡的第六大原因。根据病理分型,食管癌可分为食管鳞状细胞癌(Esophageal squamouscellcarcinoma,ESCC)和食管腺癌(Esophageal Adeocanrcinoma,EAC)。中国是世界上食管癌最高发的区域之一,在中国,食管癌患者多为食管鳞状细胞癌。虽然多学科诊疗的在不断进步进步,包括新的手术方式的改进,分子靶向治疗,化疗放疗等,但食管癌的五年生存率仍然较差。所以,探索食管癌的癌变机制是迫切和必要的,这可能为临床上食管癌的治疗提供新的靶点和突破。膜相关的酪氨酸/苏氨酸1蛋白激酶(Protein kinase,membrane associated tyrosine/threonine,PKMYT1)是是Wee蛋白激酶家族的一员,在细胞周期中通过在G2/M期阻止细胞进入分裂期而发挥负性调节作用。目前在多种恶性肿瘤中已经发现了 PKMYT1的高表达,但是在食管癌中其机制作用却不清楚,本研究旨在探究PKMYT1表达对食管鳞癌患者预后的影响,以及其在食管癌进展中发挥的组作用及涉及的相关机制,为食管麟癌的治疗提供新的思路。方法1.通过对基因表达谱分析数据库(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)中的食管癌数据进行分析,比较癌和癌旁组织中PKMYTlmRNA的表达差异。同时利用其基因图谱信息分析了 PKMYT1同食管癌相关基因表达的相关性。2.通过收集临床新鲜标本及病理切片建立患者数据库,通过荧光定量PCR以及免疫组化分析PKMYT1在食管癌患者中的mRNA及蛋白表达情况。通过对患者临床资料采集及随访,探究其与食管鳞癌患者预后的关系。3.在食管鳞癌细胞系和正常食管细胞中利用荧光定量PCR技术检测PKMYT1的表达,同时选取表达较高的食管鳞癌细胞系进行下一步研究。4.利用RNAi干扰技术在食管癌细胞系中敲低PKMYT1的表达,通过荧光定量PCR及免疫印迹实验(Western blot)检测干扰效果。5.食管癌细胞系PKMYT1表达降低后通过CCK8和平板克隆实验来研究食管癌细胞增殖能力的改变。通过流式细胞术进行细胞凋亡实验以及通过免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白的改变研究食管癌细胞抗凋亡能力的改变。6.通过划痕实验和细胞迁移和侵袭实验验证食管癌细胞运动及侵袭能力的改变。并通过免疫印迹实验和免疫荧光实验检测相关蛋白的表达变化。结果1.在GEPIA数据库中,PKMYT1在食管癌中癌组织的表达明显高于癌旁组织(p<0.05),同时PKMYT1的表达水平和蛋白激酶B(AKT)、扭曲蛋白(TWIST)及增殖相关核标记物(Ki67)的表达呈强相关性。2.在食管鳞癌患者中,PKMYT1的表达明显高于癌旁组织(p<0.01),同时PKMYT1高表达的患者相比低表达的患者有更短的无病生存期和生存期。对于食管鳞癌患者的临床信息进行分析发现PKMYT1与患者的淋巴结转移,肿瘤分化级别以及食管癌的病理分期均有明显的关系。同时通过Cox回归分析进行单因素和多因素分析,可以得出PKMYT1的表达是食管鳞癌患者预后的独立危险因素。3.通过对食管癌鳞癌细胞系及食管永生化上皮细胞的PKMYT1表达进行分析,发现在食管鳞癌细胞系中PKMYT1表达高于食管正常细胞,其中KYSE70及KYSE450细胞中表达水平最高,选取这两种细胞系进行下一步实验。4.通过siRNA对KYSE70及KYSE450细胞进行转染后检测,发现处理后的细胞PKMYT1表达水平明显下降。5.在食管癌细胞系中PKMYT1的表达降低抑制了细胞增殖,使得食管癌细胞中G2/M期细胞比例下降,同时促进了细胞的凋亡。6.PKMYT1的表达降低抑制了食管癌细胞的增殖和侵袭能力,免疫印迹实验及免疫荧光实验结果显示神经性钙粘蛋白(NCAD),扭曲蛋白(TWIST)和波形蛋白(VIM)的表达降低,同时上皮型钙粘蛋白(ECAD)的表达升高,表明食管癌细胞的上皮细胞-间充质转化(EMT)发生了逆转。同时我们也通过免疫印迹实验检测了 AKT/mTOR信号通路的表达,发现AKT/mTOR通路的表达也受到了抑制。结论PKMYT1在食管鳞癌的癌组织和癌旁组织中存在差异性表达,且PKMYT1的高表达和食管鳞癌患者的不良预后密切相关。在细胞水平降低PKMYT1的表达可以抑制AKT/mTOR信号通路的表达,从而抑制食管癌细胞的增殖,促进其凋亡;同时抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力,逆转EMT的过程,削弱食管癌细胞的功能。PKMYT1可能成为食管鳞癌治疗中一个新的潜在靶点。