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背景与目的:乳腺癌（BC）是女性最常见的癌症,与肺癌和结肠癌一起,被认为是全球最常见的三大癌症,发病和死亡率居高不下。乳腺癌分子分型复杂,与临床治疗和预后关系密切。根据 Human epidermal growth factor receptor 2（HER2）、Estrogen receptor（ER）、Progestrogen receptor（PR）检测把乳腺癌分为若干类型,其中三阴性、HER-2阴性都难以使用乳腺癌最有效的激素治疗,而这些类型发病隐匿、进展快,易于漏检,造成早期转移,所以这些类型病人往往丧失手术时机或不能手术,因而化疗成为治疗的唯一手段。但目前乳腺癌因以下原因存在药物毒性巨大、疗效不明显、治疗预后不佳:（1）药物缺乏靶向性或靶向性不足;（2）超过50%的病例都会快速产生对药物的多药耐药性（MDR）。所以,提高化疗药物的靶向性和抗MDR特性是新一代化疗药物研发的有效着力点。阿霉素（DOX）是应用于临床的一线广谱抗肿瘤药物,广泛用于实体瘤和血液恶性肿瘤的治疗,对肿瘤细胞具有明显的杀伤效果。但DOX巨大的心脏毒性、骨髓抑制以及消化系统、皮肤反应等严重影响了其使用及疗效。为了改善DOX的疗效,国际上早已推出了 DOX的脂质体剂型Lipo-DOX,国内也早已上市。但是,Lipo-DOX只是由于易与细胞膜融合而提高药物的摄入量,仍然不具备明显的癌细胞靶向性和抗MDR特性,所以Lipo-DOX的毒性仍然很大,疗效仍不理想。我们基于癌细胞靶向性和抗MDR这两项基本要求和思路,设计了如下乳腺癌多肽导向的、具有MDR抑制效应的DOX脂质体载药体系,对它的乳腺癌疗效进行了体外研究,并对其癌细胞杀伤增强和MDR抑制的机制进行了分析。实验室前期筛选得到了靶向乳腺癌Luminal A型细胞MCF-7的12肽CSB1,通过一系列检测证明CSB1对乳腺癌细胞/组织具有高度的结合特异性和敏感性,所以本研究以CSB1作为Lipo-DOX的乳腺癌导向元件。本实验室既往研究、文献报道、数据库分析都提示miRNA101可以抑制若干MDR形成有关的基因的表达,所以本研究以它的前体（Pre-miRNA101）表达质粒作为MDR的抑制元件。通过以上分析和考虑,本研究设计构建了靶向BC细胞的具有逆转MDR特征的DOX脂质体载药体系——CSB1-Lipo-DOX-miR101,以期达到高效低毒、无或弱MDR的BC治疗效果。该设计符合目前临床乳腺癌治疗急需解决的瓶颈问题的需要!方法:1.利用网络数据库分析BC细胞靶向肽CSB1的理化性质,并对其靶点进行预测分析。2.通过薄膜超声分散技术合成得到CSB1修饰连接的脂质体,以硫酸铵主动载药技术包封DOX药物,通过静电吸附作用,将带负电的Pre-miRNA101表达质粒连接到阳离子脂质体上,得到BC细胞靶向的、具有MDR抑制特性的DOX脂质体递送体系—CSB1-Lipo-DOX-miR1 01。3.应用激光粒度仪、透射和扫描电子显微镜、荧光分光光度计等方法检测CSB1-Lipo-DOX-miR101的粒径、形态均一性、包封率等指标。4.用表达GFP的质粒代替Pre-miRNA101表达质粒（pcDNA6.2-GW/miRNA）对CSB1-Lipo-DOX-miR1 01的转染效率和靶向性进行评估。5.MCF-7和DOX抗性MCF-7（MCF-7/ADR）细胞转染:分为野生细胞组、CSB1-Lipo 组、CSB1-Lipo-DOX 组、CSB1-Lipo-DOX-miR101 组,总计 8 组。6.应用MTT法、损伤修复法、Transwell、细胞核染色、扫描电镜等技术检测CSB1-Lipo-DOX-miR101对MCF-7和MCF-7/ADR细胞的杀伤力,对其增殖和运动力的抑制,以及对这些细胞的凋亡及形态结构的影响。7.网络数据库分析:分析miRNA101潜在的MDR相关靶基因以及BC恶性表征相关基因。8.结合数据库分析结果,以Western blot分析CSB1-Lipo-DOX-miR101作用的可能的靶基因的表达水平,分析CSB1-Lipo-DOX-miR101可能的BC治疗机制。结果:1.结合本室前期结果,经过本研究的进一步预测和分析,提示CSB1具有特异的BC亲和力,且其靶蛋白FLAP在BC细胞系MCF-7表面高表达。2.成功制备了 CSB1-Lipo-DOX-miR101载药体系,该脂质体呈球形、大小均一,粒径为122-141 nm,DOX药物包封率高（89%）,稳定性好且能在模拟肿瘤微环境中快速释放,符合实际需求。3.CSB1-Lipo-DOX-miR101体系转染MCF-7细胞,转染效率＞80%,CSB1的导向性良好。4.MTT、体外损伤修复、Transwell、DAPI染色、MitoScene 633染色、考马斯亮蓝染色、扫描电镜、细胞平板克隆等结果表明CSB1-Lipo-DOX-miR101对BC细胞、特别是对DOX耐受的BC细胞（MCF-7/ADR）具有显著的杀伤力,抑制了细胞的增殖、运动迁移的能力,促进DOX诱导的BC细胞的凋亡过程,并抑制了 MDR的形成。5.通过网络预测分析,miRNA101可以与多个MDR相关基因的种子区相结合。结合 Western blot 结果,CSB1-Lipo-DOX-miR101 脂质体对 MDR 及 EMT 相关的以下基因的表达产生了明显抑制:ABCC5、EZH2、APEX1、ITGB1、PCNA、VIM、Snail1、MMP2 等。结论:1.初步实验结果证明CSB1-Lipo-DOX-miR101是一种新型的对BC细胞特异靶向的药物递送体系,对MCF-7,特别是对耐药性BC细胞MCF-7/ADR具有明显的的杀伤力。2.CSB1-Lipo-DOX-miR101对DOX的MDR形成有显著抑制作用,使得药物可以持续发挥杀伤作用。这对提高DOX对BC的临床治疗效应、降低毒副作用、降低复发率等方面具有重要意义。3.CSB1-Lipo-DOX-miR101对BC的临床治疗效应及MDR抑制的机制可能是它通过对以下基因表达的抑制实现的:ABCC5、EZH2、APEX1、ITGB1、PCNA、VIM、Snail1、MMP2 等。