论文部分内容阅读
石榴皮多酚（PPP）是石榴植株体内的复杂酚类次生代谢物，具有多元酚结构，主要存在于果皮、根、叶、种子中，以果皮中含量最丰富。前人研究表明，PPP具有抗菌、抗过敏、免疫调节、保护胃、降血压、延缓衰老及保护心脏等多种生理和药理活性作用。但是PPP对束缚-浸水应激（RWIS）大鼠胃运动的中枢调节机制未见报道。本研究在对RWIS是否影响PPP在大鼠主要器官内分布的调查基础上，通过侧脑室注射给药，观察PPP对RWIS致大鼠胃黏膜损伤的预防作用、胃运动的调节、脑干神经元活动的影响，探索PPP的中枢作用及其机制，为PPP药用价值的评估提供新思路。本文的实验研究分为五部分：一、RWIS对PPP在大鼠主要器官内分布的影响利用FeCl3与多酚反应显色、与梯度多酚构成色阶，比色法检测多酚在器官内的含量。Wistar雄性大鼠250300g，灌胃给药，随机分为对照Ⅰ组（2mL去离子水+RWIS, n=5）；对照Ⅱ组（1000mgAEPP、未应激）和实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（分别为10、100、1000mgAEPP+RWIS）3个剂量组。给药1h后行RWIS3h。过量麻醉处死动物，心脏灌流除血，取脑、心、胃、肺、肝、肾、回肠、结肠匀浆，离心，取上清液与FeCl3反应。结果显示：检测石榴皮多酚的最佳FeCl3浓度为9%。呈色反应的石榴皮水提物浓度为0.2～0.5mg/ml。在大鼠的脑、心、肺、肝、肾上清液中未观察到呈色反应。实验Ⅲ组胃、结肠上清液与FeCl3反应阳性；而对照Ⅱ组的回肠、结肠也呈阳性，且高于实验Ⅲ组。结果提示，9%FeCl3可检测出0.2～0.5mg/mL石榴皮水提物中的多酚。并且PPP在胃肠壁中分布多于其它器官组织。RWIS使大鼠胃壁中PPP含量增多，回肠和结肠壁内含量减少。二、PPP对RWIS致大鼠胃粘膜损伤指数的影响采用侧脑室微量注射给药的方法，观察PPP对RWIS导致的胃粘膜损伤的预防作用。Wistar雄性大鼠250300g，随机分为对照Ⅰ组（侧脑室注射saline5μL,n=5）：对照Ⅱ组（侧脑室注射除多酚PPE100μg）和实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ（侧脑室分别注射PPP1μg、10μg、50μg、100μg）四个剂量组。给药半小时后，行RWIS3h，过量麻醉处死动物，心脏灌流，取胃，在4%多聚甲醛固定液固定30min后，沿胃大弯剖开，肉眼检测胃粘膜损伤情况，即胃溃疡指数。结果显示：与saline组和除多酚PPE组比较，1～10μg PPP组，胃黏膜损伤指数明显减小（p<0.05，p<0.01）；50μg PPP组，胃黏膜损伤指数差异不显著（p>0.05）；100μg PPP组，胃黏膜损伤指数明显增高（p<0.01）；提示侧脑室给予1～10μg PPP对RWIS诱发的胃黏膜损伤有预防作用。而50μg PPP影响不显著；100μg PPP对应激性胃粘膜损伤形成有促进作用。三、PPP对RWIS大鼠胃运动曲线（水囊法）的影响采用侧脑室埋管微量注射方法，观察RWIS大鼠胃运动曲线的变化。动物分组同第二部分。埋管术后恢复3天，动物禁食24小时，乙醚轻度麻醉大鼠，手术将水囊植入胃内。逐层缝合、并密封腹壁伤口。大鼠清醒后，行RWIS，记录给药前后胃运动曲线。分别统计分析用药前10min、用药后:0-10min、10-20min、20-30min、30-60min（随机取10min）、60-90min（随机取10min）六个时间段胃运动曲线的频率、幅度、时程、指数。结果显示，与给药前比较，给药后10μg-100μgPPP组应激状态下各时间段的大鼠胃运动曲线的频率、幅度、时程、指数均有不同程度增加（p<0.01），而1μgPPP组、除多酚PPE组与saline组的差异均不显著（p>0.05）。结果表明，侧脑室注射10μg-100μgPPP可能有促进胃运动的作用；给予1μgPPP，100μg除多酚PPE时对胃运动的调节作用不明显；证明对大鼠胃运动起调节作用的有效成分是PPP。四、PPP对RWIS大鼠迷走背核、孤束核、疑核、蓝斑核中Fos蛋白表达的影响以Fos蛋白作为神经元兴奋的标记物，利用免疫组织化学的方法，观察侧脑室注射不同浓度的PPP对RWIS大鼠的迷走背核、孤束核、疑核、蓝斑核中Fos蛋白表达量的变化，以了解PPP对RWIS诱发的脑干中神经元活动的影响。动物分组同第二部分。研究结果显示：与saline组比较，侧脑室注射不同浓度PPP均可诱导RWIS大鼠蓝斑核中Fos蛋白的表达显著增加（p<0.01），而孤束核、迷走背核、疑核中Fos蛋白表达显著降低（p<0.01），提示在RWIS中，PPP可促进大鼠蓝斑核内神经元活动加强，使孤束核、迷走背核、疑核中的神经元活动减弱。其调节作用分别呈一定的正、负相关量效关系。五、PPP对RWIS大鼠迷走背核、孤束核、疑核、蓝斑核中儿茶酚胺类神经元活动的影响采用酪氨酸羟化酶免疫反应（TH-IR）单标技术，Fos蛋白和酪氨酸羟化酶免疫反应（Fos+TH-IR）双标技术，观察侧脑室注射不同浓度的PPP对RWIS大鼠的迷走背核、孤束核、疑核、蓝斑核中儿茶酚胺类神经元活动的影响。实验分组同第二部分。结果显示：与saline组比较，侧脑室注射不同浓度PPP各组，其蓝斑核和黑质中TH-IR增强、Fos+TH-IR阳性神经元均增多，提示PPP可促进蓝斑核和黑质中儿茶酚胺类神经元活动及合成酪氨酸羟化酶作用加强；而在孤束核、迷走背核和疑核中TH-IR减弱、Fos+TH-IR阳性神经元均减少；提示PPP可抑制孤束核、迷走背核和疑核中儿茶酚胺类神经元的活动及酪氨酸羟化酶合成作用。综上所述，本研究证实了石榴皮多酚可影响脑干内儿茶酚胺能神经元的活动，进而调节胃运动，以预防RWIS引起的胃黏膜损伤。本研究的实验结果将为PPP的进一步研究与开发提供初步的实验依据，并为系统研究和开发其他植物多酚提出了良好的思路。然而，关于PPP影响儿茶酚胺类神经元活动的药理学靶点还需要进一步研究。