【摘 要】
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翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）是中国水产养殖中一种重要的特色品种。DNA甲基化是一种表观遗传学调控重要机制,其发挥作用的主要基因是DNA甲基化酶。DNA甲基化酶（dnmts）作为一类基因家族,以往研究中主要集中于人类、小鼠、果蝇和斑马鱼等的模式生物中。本实验立足于分子生物学的角度,详细分析了dn mts在鳜的发育过程和不同组织的表达分布,探讨了其在鱼类性腺发育和胚胎发育过程中的作用,
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翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）是中国水产养殖中一种重要的特色品种。DNA甲基化是一种表观遗传学调控重要机制,其发挥作用的主要基因是DNA甲基化酶。DNA甲基化酶（dnmts）作为一类基因家族,以往研究中主要集中于人类、小鼠、果蝇和斑马鱼等的模式生物中。本实验立足于分子生物学的角度,详细分析了dn mts在鳜的发育过程和不同组织的表达分布,探讨了其在鱼类性腺发育和胚胎发育过程中的作用,并研究了在不同生存环境条件（营养成分和盐度）刺激下,Sc-dnmts表达模式的变化。首先对鳜17个不同组织（皮肤、鳃、伪鳃、肌肉、肝、中肾、头肾、心肌、脑、脾脏、胆囊、食道、胃、幽门盲囊、肠、精巢和卵巢）以及9个发育时期（2-细胞期、1K-细胞期、囊胚期、原肠胚期、色素期、尾芽期、出膜前、出膜1天、出膜5天）进行高通量测序,并利用测序结果,分离出4个鳜鱼DNA甲基化酶Unigene。本研究克隆了Sc-dnmts,即dnmt1、dnmt2、dnmt3a和dnmt3b,并进行了蛋白质分子特征分析。Sc-dnmts之间的一般结构存在差异性,但总体分成N端的调控结构域和C端的催化结构域。不同物种间蛋白质序列比对和结构显示Sc-Dnmts的N端不保守并存在多个结构域,C端仅含有Dcm一个结构域且高度保守,结构的不同与dnmts发挥的功能不同有关。系统进化树结果显示,相较于dnmt1与dnmt2,dnmt3家族基因的生物进化历程不保守,存在分歧。虽然Sc-dnmts在不同组织和胚胎发育时期均有表达,但表达量仍存在组织和发育时期差异性。在鳜性腺中,dnmt1在卵巢中高表达,dnmt2均能在精巢和卵巢中高表达,而dnmt3a与dnmt3b在精巢中高表达。同时免疫组化结果也证明在鳜鱼精巢的生精小管中存在Dnmt2蛋白,精母细胞中存在Dnmt2和Dnmt3a;在II或III期鳜卵巢中的初级卵母细胞中Dnmt2高表达,Sc-Dnmt3a则在初级卵母细胞中显示微弱的阳性信号。结果表明Sc-dnmt2和Sc-dnmt3a可能在鳜精巢和卵巢的发育过程中具有重要的作用。在胚胎发育不同时期中,Sc-dnmts的表达存在明显的时空表达差异性。Scdnmt1和Sc-dnmt2在刚受精后2-细胞期时高表达,随即下降;Sc-dnmt3a从原肠期开始表达;Sc-dnmt3b在刚受精时表达量极低,但在囊胚期表达上升。4种Sc-dnmt均在胚胎发育时期的表达水平出现波折,并且结合硬骨鱼蛋白互作网络与鳜不同发育时期的TPM值分析发现,存在一些共有蛋白与Sc-dnmts在鳜不同发育时期共表达或可能发生协同作用,包括EZH2、QTRT1、MAT2B和H3,表明dnmts可在生物胚胎发育中起到重要作用,包括鱼类发育过程中特定器官的分化和生长发育等。为响应不同生存环境条件（营养成分、盐度和药物）刺激,Sc-dnmts的表达模式会发生不同程度的改变。⑴人工饲料驯化后,Sc-dnmts在肝、胃和肠道中的表达水平都发生了变化。如Sc-dnmt1在驯化后肝脏中的表达水平显著提高;Sc-dnmt2仅在驯化后肝脏中的表达量显著增加,但在肠中却又下降;Sc-dnmt3a在驯化后肝脏和胃部中的表达水平均有提升;Sc-dnmt3b在驯化后胃中的表达水平显著增加。⑵10ppt盐度刺激后,Sc-dnmts在鳃和肠中的表达谱也改变了。在鳃中,Sc-dnmt2、3a的含量显著增加;在肠道中,Sc-dnmt1、3a、3b的表达水平显著上升。⑶LPS和Poly I:C注射后的短期时间内,几乎所有的Sc-dnmts在血液和皮肤中的表达能力下降。暗示着Sc-dnmts可能与鳜的消化摄食、能量代谢、渗透压调节及炎症反应有关。尤其是Sc-dnmt3a对不同刺激均表现出了显著的敏感性。本研究对未来研究dnmts在更多方面的应用提供了基础信息,为进一步研究dnmts的功能鉴定了基础,也增加了dnmts在硬骨鱼中的研究丰度。
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