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3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)是一种重要的化工原料,由于具有两个活性末端,可以生产各种化学品,被广泛应用于医药,农业和材料等领域。由于其显著的市场价值和广泛的应用前景,3-羟基丙酸在2004年和2010年两次被美国能源部列为优先开发的平台化学品。本课题以谷氨酸棒杆菌为宿主,通过代谢工程手段改造,首次实现了在谷氨酸棒杆菌中通过丙二酰辅酶A途径利用乙酸生产3-羟基丙酸。
首先在谷氨酸棒杆菌中以质粒形式表达了C.aurantiacus来源的双功能酶基因丙二酰辅酶A还原酶基因mcr,引入了3-HP合成途径。随后通过在MCR中引入已知的有利突变点、对MCR的N端和C端的拆分表达、倒序融合拆分表达、使用强启动子表达等策略提高工程菌中MCR的酶活。随后,为了提高前体物乙酰辅酶A的胞内含量,我们对柠檬酸合酶的表达进行了梯度弱化以降低乙酰辅酶A进入TCA循环的通量:首先考察了三个不同强度的弱启动子弱化表达gltA对3-羟基丙酸合成的影响,随后在效果最好的启动子Pp1的基础上进一步将gltA基因的起始密码子替换为TTG,构建的工程菌株Cgs13利用9.91g/L的乙酸生产了3.73g/L3-HP。
我们在菌株Cgs13中解除乙酰辅酶羧化酶(ACC)的负反馈调节以提高从乙酰辅酶A到前体物丙二酰辅酶A的通量,但得到的工程菌株Cgs16的3-HP产量没有提升反而略微下降,而在没有强化乙酰辅酶A供给的Cgs8中进行同样的基因操作却导致3-HP的产量的明显提高,推测Cgs16中ACC和MCR的酶活不匹配导致上述结果。为了验证后续对菌株Cgs13脂肪酸合成途径改造的潜力,在发酵12h时添加15μmol/L浅蓝菌素,3-HP的产量提高到了4.67g/L。最后,为了进一步提高丙二酰辅酶A还原酶的酶活并增强其表达的稳定性,我们在菌株Cgs13的基因组上ldhA位点整合了一个拷贝的mcr基因,在5L发酵罐流加培养中,其3-HP产量达到了14.90g/L。
本研究通过在谷氨酸棒杆菌中引入丙二酰辅酶A还原酶,梯度弱化柠檬酸合酶,添加浅蓝菌素抑制脂肪酸合成途径,发酵罐放大等实验,构建了一株高效利用乙酸合成3-HP的工程菌株,首次实现了在谷氨酸棒杆菌中通过丙二酰辅酶A途径利用乙酸生产3-HP,产量达到同类研究公开报道的最高水平。
首先在谷氨酸棒杆菌中以质粒形式表达了C.aurantiacus来源的双功能酶基因丙二酰辅酶A还原酶基因mcr,引入了3-HP合成途径。随后通过在MCR中引入已知的有利突变点、对MCR的N端和C端的拆分表达、倒序融合拆分表达、使用强启动子表达等策略提高工程菌中MCR的酶活。随后,为了提高前体物乙酰辅酶A的胞内含量,我们对柠檬酸合酶的表达进行了梯度弱化以降低乙酰辅酶A进入TCA循环的通量:首先考察了三个不同强度的弱启动子弱化表达gltA对3-羟基丙酸合成的影响,随后在效果最好的启动子Pp1的基础上进一步将gltA基因的起始密码子替换为TTG,构建的工程菌株Cgs13利用9.91g/L的乙酸生产了3.73g/L3-HP。
我们在菌株Cgs13中解除乙酰辅酶羧化酶(ACC)的负反馈调节以提高从乙酰辅酶A到前体物丙二酰辅酶A的通量,但得到的工程菌株Cgs16的3-HP产量没有提升反而略微下降,而在没有强化乙酰辅酶A供给的Cgs8中进行同样的基因操作却导致3-HP的产量的明显提高,推测Cgs16中ACC和MCR的酶活不匹配导致上述结果。为了验证后续对菌株Cgs13脂肪酸合成途径改造的潜力,在发酵12h时添加15μmol/L浅蓝菌素,3-HP的产量提高到了4.67g/L。最后,为了进一步提高丙二酰辅酶A还原酶的酶活并增强其表达的稳定性,我们在菌株Cgs13的基因组上ldhA位点整合了一个拷贝的mcr基因,在5L发酵罐流加培养中,其3-HP产量达到了14.90g/L。
本研究通过在谷氨酸棒杆菌中引入丙二酰辅酶A还原酶,梯度弱化柠檬酸合酶,添加浅蓝菌素抑制脂肪酸合成途径,发酵罐放大等实验,构建了一株高效利用乙酸合成3-HP的工程菌株,首次实现了在谷氨酸棒杆菌中通过丙二酰辅酶A途径利用乙酸生产3-HP,产量达到同类研究公开报道的最高水平。