为提高海南粗榧(Cephalotaxus mannii)悬浮培养细胞次生代谢产物三尖杉酯类碱的产量,本研究选取新型诱导子β-环糊精(β-cyclodextrin,β-CD)及DNA去甲基化剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对细胞进行处理。在培养过程中,分别向培养基中添加不同浓度的β-CD(5、15、25、35 mmol/L)和5-Aza-CdR(15、25、35 μmol/L),通过对培养过程中细胞生长速率、细胞活力、糖耗速率、三尖杉酯类碱产量及一些关键酶活力进行测定,考察β-CD及5-Aza-CdR对海南粗榧悬浮细胞生长及产物合成的影响。为进一步分析DNA甲基化与细胞衰老及产物合成的关系,分别对新诱导愈伤组织的悬浮细胞(N)、经五年传代培养的愈伤组织悬浮细胞(OCK)及其经去甲基化处理的悬浮细胞(O)进行转录组研究,分析其差异表达基因,寻找与细胞衰老及产物合成相关基因,为阐明海南粗榧细胞衰老及三尖杉酯类碱合成的分子机制奠定了基础。1.β-CD对细胞生长及产物合成的影响利用不同浓度β-CD处理海南粗榧悬浮细胞,可以显著提高产物三尖杉酯类碱含量并对细胞生长有促进作用。添加35 mmol/L β-CD,产物含量最高(2.26 mg/L),是对照组(0.54 mg/L)的4.18倍;悬浮细胞生物量为14.79 g/L,是对照组(9.79 g/L)的1.5倍。同时,β-CD能有效提高磷酸戊糖途径(Hexose monophosphate pathway,HMP途径)的关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶及莽草酸途径(Shikimate pathway)限速酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶活力。2.5-Aza-CdR对细胞生长及产物合成的影响采用不同浓度去甲基化剂5-Aza-CdR处理悬浮培养细胞,对细胞生长及产物合成均会产生促进作用。添加15 μmol/L 5-Aza-CdR使产物含量提高29.67%,细胞干重提高13.75%。同时,5-Aza-CdR能有效提高6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate,G6PDH)、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase,DS)及丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)活性,为产物合成提供更多碳源。通过对细胞培养周期内甲基化程度进行测定,发现海南粗榧悬浮细胞在培养周期内DNA甲基化程度呈先下降后上升趋势,添加5-Aza-CdR可以降低培养早期(0-15 d)细胞甲基化水平。3.DNA甲基化与细胞衰老及产物合成的关系通过转录组分析发现,DNA去甲基化可以降低细胞中蛋白磷酸酶2C(protein phosphata,PP2C)及生长素(auxin,indole acetic acid,IAA)的负调控因子Aux/IAA(auxin/indole-3-acetic acid)、SA UR(small auxin up RNA)表达量,提高生长素响应因子ARF(auxin response factor,ARF)表达量,进而提高细胞抗逆境胁迫能力,减缓细胞衰老促进细胞生长。同时DNA去甲基化可以提高糖酵解途径中果糖激酶及醛缩酶合成相关基因的表达量,为细胞提供更多的ATP及三尖杉酯类碱合成前体磷酸烯醇式丙酮酸,促进细胞生长及产物合成。