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目的:随着癌症患者生存率的显著提高,化疗引起的卵巢早衰（Premature ovarian failure,POF）和不孕已经成为癌症幸存年轻女性面临的主要问题之一。虽然卵母细胞和胚胎深低温能够帮助保存化疗引起的POF患者怀孕,但研究保护女性癌症患者因化疗药物造成的POF并最大程度恢复卵巢功能,对维持女性特征和提升她们的生活质量,具有重大的临床价值和现实意义。二甲双胍（Metformin,Met）近年来被证实可以有效治疗多囊卵巢综合征、子宫肌瘤等女性生殖方面疾病,但是否可以缓解化疗药物对卵巢的毒性损伤,重塑卵巢功能尚不清楚。本研究旨在探讨Met对临床化疗导致POF的缓解和拯救作用,并阐明其保护卵巢功能的相关机制,为临床治疗POF、卵泡发育障碍及不孕不育提供新思路和新策略。方法:利用化疗药物环磷酰胺和白消安构建POF小鼠模型,采用连续灌胃Met;体外原代培养颗粒细胞（Granulosa cell,GC）,提取M1型巨噬细胞上清液（M1-CM）处理GC模拟POF卵巢微环境变化。本研究拟从组织和细胞层面观察Met对POF小鼠的保护作用,采用qPCR、HE、WB、ELISA、IF等技术,探究Met在保护化疗药物所致POF中的具体分子机制。具体方法如下:1.通过对6周龄雌性昆明（KM）小鼠腹腔注射环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）（120mg/m L）和白消安（Busulfan,Bu）（30mg/m L）构建卵巢POF模型,以腹腔注射生理盐水的6周龄健康雌性KM小鼠为对照组,30天后摘取卵巢组织,HE染色观察卵巢组织结构,并行卵泡计数验证造模效果和化疗药物对卵巢的损伤。2.通过qPCR和WB技术检测检测各组卵巢组织中M1型巨噬细胞分子标志物CD86、INOS和M2型巨噬细胞标志物CD206和ARG-1的表达水平,炎性细胞因子IL-6、TNF-a的表达水平,以及衰老标志物p53、p21的表达水平和抗氧化酶CAT、GPx、SOD2的m RNA水平。3.造模开始7天后,按照260mg/kg/d的剂量对卵巢早衰灌胃给药Met,连续3周,期间对小鼠体重和发情周期进行动态监测,在治疗周期结束后,摘取小鼠卵巢,比较不同组别卵巢大小,通过HE染色和卵泡计数验证治疗效果;通过qPCR技术,检测卵巢功能标志物AMH表达情况,通过ELISA技术检测小鼠血清激素FSH、E2分泌水平。4.通过qPCR和WB技术检测Met灌胃治疗后,卵巢组织中巨噬细胞标志分子CD86、CD206、ARG-1、INOS,细胞因子IL-6、IL-10、TNF-a,抗氧化酶CAT、GPx、SOD2的表达差异;利用比色法测定组织清除羟基自由基（OH-）的能力;利用黄嘌呤氧化酶法测定组织SOD活力。5.用LPS（1mg/m L）诱导RAW264.724h,使细胞向M1型巨噬细胞定向分化,提取原代GC,通过形态学观察和免疫荧光技术及qPCR检测分子标志物表达鉴定细胞类型。6.收集M1型巨噬细胞上清液,实验组利用M1-CM刺激24h小鼠原代GC,模拟POF卵巢组织中M1型巨噬细胞过度激活状态,治疗组提前用5m M二甲双胍预处理24h,通过WB检测炎性细胞因子TNF-a、IL-6和衰老标志物p53、p21的表达;荧光探针法检测细胞活性氧水平;β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞数量变化;通过qPCR技术检测衰老相关分泌表型（SASP）的表达水平。7.下载基因表达微阵列数据GSE128240,利用生物信息学技术分析对照组卵巢和化疗药物处理卵巢的差异表达基因,利用差异基因富集相关通路,通过WB技术检测AMPK相关通路分子（AMPK及p-AMPK、SIRT1、PPAR-g）在不同处理组之间的表达差异。结果:1.POF小鼠卵巢体积萎缩,原始卵泡和各级生长卵泡数量不同程度减少,闭锁卵泡数量显著增加,卵巢功能明显受损,表明小鼠POF造模成功。2.POF组与CON组小鼠卵巢组织中M1型巨噬细胞分子标志物CD86、INOS表达增加,M2巨噬细胞标志物CD206、ARG-1表达减少,炎性细胞因子IL-6、TNF-a分泌增多,衰老标志物p53、p21表达增加,抗氧化酶CAT、GPx、SOD2表达减少。3.二甲双胍灌胃治疗后,POF小鼠体重有一定程度增加,卵巢体积和功能得到有效恢复,异常发情周期率降低,各级生长卵泡数量趋于正常水平,原始卵泡率从14.6%恢复到32.4%,闭锁卵泡率从62.5%降低到20.5%,血清FSH浓度降低而E2浓度升高,卵巢储备指标AMH表达上调。4.Met灌胃治疗后,巨噬细胞标志分子CD86、INOS表达减少,CD206、ARG-1表达增加,促炎细胞因子IL-6、TNF-a表达减少,抑炎细胞因子IL-10表达增加,抗氧化酶CAT、GPx、SOD2 m RNA表达上调,组织清除OH-能力上升,组织总SOD活力和Cu-SOD活力均增加。5.1mg/m L LPS诱导24h细胞由圆形生出伪足,并且M1型巨噬细胞标志分子m RNA表达增加,M1极化诱导成功;原代提取细胞FSHR免疫荧光染色胞质着色明显,鉴定原代细胞确为卵巢颗粒细胞。6.M1巨噬细胞上清液处理GC24h后,促炎细胞因子IL-6、TNF-a表达显著增加,衰老标志物p53、p21表达增加,同时细胞中代表活性氧的绿色荧光增加,代表衰老细胞的蓝色染色增加;5m M Met预处理24h显著下调了细胞衰老标志物p53、p21的表达,减少了细胞中的绿色荧光和β半乳糖苷酶阳性细胞数量;SASP包括趋化因子CXCL10、炎性细胞因子IL-6、IL-8、TNF-a,生长因子TGF-β表达显著减少。7.生信分析结果显示,在化疗药物处理卵巢样本中PPAR通路明显富集;WB结果显示,M1-CM处理组p-AMPK/AMPK比率降低,SIRT1表达下调,PPAR-g表达增加;而Met预处理组p-AMPK/AMPK比率增加,SIRT1表达增加,PPAR-g表达减少。结论:化疗诱导的卵巢早衰的卵巢中巨噬细胞极化失衡,促炎型巨噬细胞增多,炎性细胞因子分泌增加,活性氧积累,导致颗粒细胞衰老死亡。二甲双胍通过AMPK/PPAR-g/SIRT1通路提升颗粒细胞抗炎抗氧化能力,缓解卵巢早衰。