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微生物的多样性可以反映出其生存环境的生态情况,因此土壤微生物多样性是土壤环境质量的重要指标。研究土壤铬污染生物修复过程中土壤细菌群落的变化,对探讨环境修复的生物学机理具有重要的理论指导意义。采用淹水培养后的模拟铬污染土壤为供试材料,污染土壤修复处理方式为淹水处理10d (S2),添加Fe(OH)3并淹水10 d (S3)及20 d (S4),以土壤自然淹水处理为对照(S1)。采用三种方式直接提取土壤中总细菌DNA,利用细菌专一引物63F/1387R克隆细菌16S rDNA片段。将扩增片段与pMD19-T载体进行连接反应,转入大肠杆菌JM109中,建立土壤细菌16S rDNA克隆文库。利用菌落PCR方法,通过蓝白斑筛选随机挑取约200个阳性克隆子,用pMD19-T载体通用引物M13重新扩增插入的16S rDNA片断。将纯化后的菌落PCR产物用RsaⅠ消化,酶切产物经8%丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染显色,形成了各个克隆文库的RFLP图谱。根据RFLP图谱得到细菌种群多样性数据,采用α和?多样性测度统计分析不同处理土壤细菌多样性指数。采用HhaⅠ,将S3、S4中突出的优势细菌群落16S rDNA再次酶切。选取仍然呈优势的克隆子测定序列。将测序结果提交NCBI经BLAST比对,得到同源序列及种属信息。采用ClustalX和Mega3.1构建系统发育树,分析优势细菌种群间的遗传关系。得出以下主要结论:1.不同处理土壤分别得到123(S1)、120(S2)、97(S3)、69(S4)个酶切类型,单克隆在不同处理中的比例分别为45.08%、44.98%、34.67%、23.40%。优势细菌数目分别为7、5、11、11个,特别是S4中出现了两种比例大于10%的OTU类型。2.不同处理土壤的细菌多样性指数:Shannon-Wiener指数(H’)分别为4.616,4.588,4.091和3.589;Gini指数分别为0.9873,0.9868,0.9708和0.9492;丰富度(dMa)分别为23.18,22.61,12.98和8.13;各处理的多样性指数变化趋势均为S1>S2>S3>S4。基于细菌多样性指数对土壤类型的聚类结果表现为S1和S2归为一类并且趋于一致;S3、S4土壤归为另一类,但相互之间存在一定差异。3. S3与S4中的优势形菌群落体现出了遗传相似性。与S3、S4中优势细菌同源性较高的种属主要有不动杆菌、荧光假单胞菌、γ-变形菌、内生菌和肠杆菌。这些细菌均属于变性菌门,是广泛存在于土壤中的厌氧细菌,且具有铬铁还原能力。