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目的:保护性自噬可被外部刺激激活,如化疗（chemotherapy,CT）和光热治疗（photothermal therapy,PTT）等,导致肿瘤抵抗。溶酶体作为自噬货物降解的关键亚细胞器,其功能障碍是实现自噬抑制的关键。此外,溶酶体药物封存增强了碱性化疗药物如阿霉素（doxorubicin,DOX）的耐药性。研究发现大多数纳米递药系统被内化到溶酶体进行降解,进一步导致了纳米递送系统介导的碱性化疗药物耐药。溶酶体作为两种耐药机制的重要亚细胞器,其酸化阻滞为同时抑制自噬和溶酶体药物封存提供了一个潜在的策略。氯离子通道-3（chloride channel-3,ClC-3）蛋白作为一种重要的Cl--H+转运体,在维持正常细胞溶酶体低p H微环境中具有重要作用。因此,本文基于溶酶体在自噬和药物封存中的重要作用,构建了基因治疗（gene therapy,GT）/CT/PTT组合治疗纳米递药系统BP-AE105-si ClC-3@DOX（简写为BP-A-S@D）,以HeLa细胞为模型验证了ClC-3在肿瘤溶酶体酸化和自噬调节中的作用及其对CT和PTT的增敏作用。方法:1.BP-A-S@D制备及表征:以黑磷纳米片（black phosphorus nanosheets,BPNSs）为载体,分别负载DOX、靶向宫颈癌的特异性配体AE105和ClC-3小干扰RNA（ClC-3 small interfering RNA,si ClC-3）,制备了GT/CT/PTT三位一体组合治疗纳米递药系统BP-A-S@D。借助高分辨透射电镜、原子力显微镜、马尔文激光粒度仪、X射线光电子能谱技术和X-射线能量色谱仪等,对BP-A-S@D进行表征,并检测了该纳米递药系统的光热转化效率。最后通过CCK-8检测了聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）和聚乙烯亚胺（polyetherimide,PEI）双官能化的BPNSs（PEG and PEI dual-functionalized BPNSs,PPBP）对HeLa的生物相容性。2.通过流式细胞术、生物透射电镜、激光共聚焦显微镜、实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）,检测了BP-A-S@D在HeLa细胞中的摄取、分布和基因沉默效果。其次,利用溶酶体p H指示探针Lysosenser Green DND-189检测了BP-AE105-si ClC-3（简写为BP-AS）介导的ClC-3沉默对溶酶体酸化的影响。3.通过WB检测了GT、CT及PTT单独及组合治疗对自噬相关蛋白LC3B及P62表达水平的影响;通过丹酰尸胺（monodansylcadaverine,MDC）荧光探针检测BP-A-S对HeLa细胞自噬的影响;通过Lyso Tracker Green DND-26探针检测了单独及组合治疗对HeLa细胞溶酶体的影响;通过bioTEM观察了不同疗法处理后HeLa细胞内形成的自噬体和自溶酶体。4.利用CCK-8细胞毒性实验及Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒,检测了GT介导的溶酶体酸化阻滞及自噬抑制对CT和PTT的增敏效果。最后通过Transwell细胞迁移和侵袭实验以及细胞划痕愈合实验,评估了BP-A-S介导的ClC-3沉默对HeLa细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:1.成功构建了多功能纳米递药系统BP-A-S@D。该系统对比度低、分散性好,粒径约为185.7nm,有利于通过增强的通透性和滞留（enhanced permeability and retention effect,EPR）效应靶向肿瘤。PPBP在测试浓度下对HeLa细胞具有良好的生物相容性。基于其良好的光热转化效率及较大的比表面积,该体系可用于PTT、CT和GT。2.揭示了ClC-3在Hela细胞溶酶体酸化中的重要作用:1)AE105多肽的偶联通过其与HeLa细胞膜受体u PAR的亲和力增强了癌细胞对BP-A-S的摄取,极大地提高了BP-A-S的转染效率;2)BP-A-S浓度依赖性地下调了HeLa细胞ClC-3 mRNA及蛋白表达水平;3)si ClC-3通过抑制溶酶体酸化阻断溶酶体的形成,这不仅促进了纳米递药系统从溶酶体的释放,而且减少了溶酶体对DOX的截留,从而提高了DOX的生物利用度。3.揭示了si ClC-3介导的ClC-3沉默在HeLa细胞自噬调节中的重要作用:1)BP-A-S介导的ClC-3沉默通过抑制溶酶体酸化减少自溶酶体的形成,将自噬阻断在溶酶体对自噬货物的降解阶段;2)ClC-3沉默可以逆转BPNSs、CT和PTT诱导的自噬活性,有望进一步提高CT和PTT的抗癌效率。4.si ClC-3介导的溶酶体酸化阻滞及自噬抑制与BP介导的PTT和DOX介导的CT相结合,显著提高了抗癌效率。si ClC-3介导的GT协同CT和PTT提高了对HeLa细胞的抗增殖效率。同时,ClC-3沉默抑制了HeLa细胞的迁移和侵袭。结论:本文成功构建了多功能纳米递药系统BP-A-S@D,揭示了ClC-3沉默在Hela细胞溶酶体酸化阻滞及自噬抑制中的重要作用。首先,si ClC-3通过抑制溶酶体酸化阻断溶酶体的形成,这不仅促进了纳米递药系统从溶酶体的释放,而且减少了溶酶体对DOX的截留,提高了DOX的生物利用度。其次,si ClC-3抑制CT和PTT诱导的保护性自噬,增强CT和PTT对HeLa细胞的细胞毒性。最后,ClC-3沉默同时实现了对Hela细胞的抗增殖和抗侵袭作用。简而言之,ClC-3沉默提供了一种同时抑制自噬和溶酶体药物封存的有效策略,协同CT和PTT提高对HeLa细胞的抗增殖和抗侵袭效率。