新型酰胺类局麻药盐酸罗哌卡因自投入临床以来，广泛应用于硬膜外阻滞、上下肢周围神经阻滞及局部浸润麻醉等，但对于罗哌卡因用于蛛网膜下腔时的脊神经毒性还存有争议。已知浓度是影响局麻药脊神经毒性的一个重要因素。目前临床上较为常用的是0.75％、0.5％、或经葡萄糖稀释而得的0.5％罗哌卡因三种浓度，1％的罗哌卡因由于其高度可疑的脊神经毒性而应用较少。局麻药的脊神经毒性反应导致的神经损伤，是临床麻醉与疼痛治疗中的严重并发症，一旦发生尚无有效的治疗措施，目前只能以预防为主。如何在确保麻醉效果的同时，又能消除局麻药对于脊髓神经的毒性，保证病人的健康和安全，是迫切需要解决的问题。　　 迄今为止，关于局麻药对脊髓神经毒性的确切机制尚不十分清楚。各种学说各有优缺点，但是都不能给出完全科学的解释。蛋白质组学是后基因时代兴起的大规模、整体性研究蛋白质结构和功能的主要手段，具有高通量和高效率的特点，逐渐成为生命科学研究的前沿和热点。借助蛋白质组学的方法，动态、定量、全方位地观察脊神经损伤后发生发展过程中蛋白质种类、数量的改变，研究基因产物的合成率、降解率、翻译后修饰程度、亚细胞水平的分布以及与其它细胞成分的相互作用等具有极其重要的意义，为从蛋白质水平上探讨局麻药脊神经毒性的机理提供了可能。　　 本实验拟采用一种改良的经腰椎鞘内置管方法，将不同浓度、不同配制方法的罗哌卡因及0.75％的布比卡因用于大鼠蛛网膜下腔，对大鼠行为学指标进行评价、通过电镜观察用药后脊髓和脊神经根的超微结构改变、利用双相凝胶电泳和飞行质谱技术对大鼠脊髓的蛋白质组变化进行分析、鉴定，获得有关蛋白质性质、表达变化及翻译或加工等信息，为从蛋白质分子水平揭示局麻药脊神经毒性的机制奠定基础，并对不同浓度及药物种类等影响因素进行比较，为临床用药提供参考。　　 材料与方法　　 实验动物:健康成年SD大鼠，雄性，体重180～220g，由沈阳军区总医院实验动物中心提供。　　 主要试剂及设备:1％盐酸罗哌卡因注射液、0.75％盐酸罗哌卡因注射液、0.5％盐酸罗哌卡因注射液、0.75％盐酸布比卡因注射液、2％盐酸利多卡因注射液、10％葡萄糖溶液、0.9％氯化钠溶液、10％水合氯醛、骨蜡、吸收性明胶海绵、丙酮、醋酸铀、柠檬酸铅、锇酸、环氧树脂Epon812、2.5％戊二醛磷酸缓冲液、2％IPG上样缓冲液、考马斯亮蓝R350、2D-cleanup蛋白质提纯及定量试剂盒、胰蛋白酶、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、硫脲、3-[（3-胆酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、乙腈、3-氟乙酸、基质HCCA、PEP肽标;　　 PE-10导管(外径0.58 mm，内径0.28 mm)、50μl微量进样器、LKBⅤ型超薄切片机、JEM-100CXⅡ型透射电子显微镜、RBP-1B型大鼠血压计、ImmobilineDrystrip胶条（Ph值范围3～10、24cm）、超声波破碎仪、低温离心机、微型离心机、真空离心干燥机、深低温冰箱、紫外可见光分光光度计、Ettan IPG phorⅢ等电聚焦系统、Ettan DALT six大型垂直电泳单元、CO2恒温孵育箱、Aquapro实验室超纯水系统、UMAX扫描仪、Ettan spot picker切点仪、精密分析天平、微量移液器、高压灭菌枪头、超净工作台、 Bruker autoflexⅢ型MALDI-TOF质谱分析仪。　　 实验一:大鼠随机分为Yaksh组（Y组）和改良组（G组），每组8只。腹腔注射10％水合氯醛(100mg/kg)麻醉。Y组依改良Yaksh法经寰枕膜向大鼠尾端置管7cm，逐次缝合肌肉皮肤，固定导管，外端以热熔的蜡封闭。G组沿L3～4椎体间隙作长约2 cm的纵切口，切开筋膜，钝性分离肌肉，切除L3～4间棘上韧带、棘间韧带，暴露上、下关节突间黄韧带;右手持弯钳提起L4棘突，左手以18G针头探查并穿破黄韧带及硬脊膜，可见鼠尾突然出现侧摆或后腿抽动，同时针孔处有清亮的脑脊液外溢;经穿刺口向尾端插入PE-10导管，深度1.5cm;沿硬脊膜穿刺口周围涂抹适量骨蜡，吸收性明胶海绵填塞止血;分别于肌肉层、筋膜层及表皮三次缝扎固定导管，逐层缝合切口。置管后均单笼饲养，自由进食水。术后第3天，经导管向鞘内注射2％利多卡因40μl。记录给药后至大鼠后肢痛觉反射消失的时间。分别于置管日麻醉前15分钟、三天后注利多卡因前15分钟、注药后30分钟进行行为学检查:(1)斜板试验;(2) BBB神经功能评分。最后一次评分后断头法处死动物，4℃下迅速暴露脊髓，以导管尖端为中心切取5mm的脊髓段，2.5％戊二醛中前固定，制作超薄切片，透射电镜下观察超微结构改变。　　 实验二:大鼠随机分为7组，每组8只，均按改良法行经腰椎入路蛛网膜下腔置管。取符合要求的大鼠再单独饲养3天后按预定方案注药:N0组（空白对照组）不注药、N1组（阴性对照组）给予0.9％氯化钠、R1组给予1％罗哌卡因、R2组给予0.75％罗哌卡因、R3组给予0.5％罗哌卡因、R4组给予等体积10％葡萄糖加1％罗哌卡因配制成的0.5％罗哌卡因、B组给予0.75％布比卡因。每次注入40μl，注药时间为10秒，每间隔1.5小时一次，共3次。首次注药前5分钟及每次注药后10分钟测一次血压;置管后1小时、末次注药后1小时及24小时，以BBB神经功能评分法及斜板试验记录运动恢复情况。最后一次评分结束后断头法处死动物，以导管尖端为起点向尾端切取3mm脊髓段，固定后制作超薄切片，透视电镜下观察脊髓超微结构改变。　　 实验三:大鼠分组、置管方法及给药方案同实验二。最后一次注药24小时后断头法处死动物，以导管尖端为起点向头端切取5mm脊髓段，-70℃冻存备用。利用2D-cleanup试剂盒提取组织蛋白并进行蛋白浓度测定确定上样体积;按照GE公司双向电泳手册中提供的标准实验方案，将提纯并定量后的蛋白样本依次进行第一向等电聚焦电泳及第二向垂直SDS-PAGE电泳;透视扫描2-DE凝胶获取图象，ImageMaster2D platinum6.0软件分析并确定要切取的差异蛋白点;Ettanspot picker切点仪自动切胶，酶解并提取肽混合物，行激光解析-电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析;使用MASCOT搜索引擎在SwissProt57.12数据库中检索，搜索类型为肽质量指纹图，蛋白酶为胰蛋白酶，肽段质量范围在±100ppm，最大允许丢失的酶切位点为1个，当MASCOT评分＞51分时认为结果有统计学意义，最终得到感兴趣的蛋白质信息。　　 统计处理:计量资料以均数±标准差表示，两组均数比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，当P＜0.05认为差异有统计学意义。　　 实验结果　　 实验一:两组大鼠体重均值无统计学差异(P＞0.05);局麻药起效时间无统计学差异(P＞0.05);G组大鼠在各时点斜板实验及BBB评分无明显改变(P＞0.05);Y组在置管后BBB评分下降(P＜0.05)，与G组相比较亦有所降低(P＜0.05)，斜板实验结果无明显变化(P＞0.05)。　　 电镜观察可见两组大鼠脊髓组织超微结构基本正常，神经元胞质内可见线粒体呈圆形或椭圆形，内外膜光滑完整，嵴清晰;粗面内质网散在分布，表面附着核糖体，无脱颗粒现象。　　 Y组一只大鼠置管过程中出现呼吸困难，于置管后第二天死亡。G组大鼠术中生命体征平稳，置管后观测期内无意外死亡。　　 实验二:56只大鼠在观测期内生存良好，无意外死亡。术前各组体重组间比较无统计学差异(P＞0.05); R1组、R2组、R4组及B组在给药后收缩压较基础值有明显下降(P＜0.01，P＜0.05)，且与同时点对照组值比较也有统计学差异(P＜0.05)。其余各组收缩压变化无统计学意义。　　 R1组在末次给药后1小时及24小时BBB评分及斜板实验结果较基础值均明显下降(P＜0.05)，与对照组比较亦有统计学差异(P＜0.05)。R2组及B组在给药后两项行为学指标略有下降，但无统计学差异(P＞0.05)。　　 电镜观察:N0组及N1组大鼠脊髓组织超微结构基本正常，神经元细胞核大而圆;胞浆内线粒体呈圆形或椭圆形，内外膜完整，嵴清晰;有髓神经纤维板层结构及雪旺氏细胞基本正常。R1组大鼠脊髓组织存在明显的神经元细胞核固缩、胞浆内细胞器变性、有髓神经纤维板层分离、内外轴膜不完整等病理改变。R2组可观察到神经元细胞核膜增宽，胞浆内线粒体肿胀、嵴模糊，有髓神经纤维板层分离。R3组大鼠脊髓神经元细胞及有髓神经纤维板层结构基本正常。R4组可观察到神经元细胞核膜增宽，内质网肿胀脱颗粒，有髓神经纤维板层结构疏松。B组大鼠脊髓组织存在明显的神经元细胞胞浆内结构破坏，细胞器变性、有髓神经纤维板层分离等病理改变。　　 实验三:双向电泳结果显示N0组组内匹配率为95.5％，N1组为91.3％，R1组为83.3％，R2组为92.4％，R3组为82.6％，R4组为88.6％，B组为90.6％。N1-R1组可匹配蛋白点数为779个，其中拟切取并分析的差异蛋白点数:N1组82个，R1组50个。N1-B组可匹配蛋白点数771个，拟切取差异蛋白点数:N1组41个，B组31个。R2、R3、R4组与N1组配对比较，可匹配蛋白点数共2220个，其中拟切取并分析的差异蛋白点数: N1组96个，R2组46个，R3组60个，R4组87个。　　 质谱分析结果显示总计63个蛋白点得到相应的15种蛋白质。按表达趋势的变化将其进行分类，则局麻药作用后新出现的蛋白有HSP25;丰度升高的有8种:GFAP、MBPⅡ、ALDOA/C、TPIS、GS、ALDR、GBB1&2、ENOG;丰度降低的有5种:NFL、VDAC-2、ODPA、SIRT2、KCRB;消失的有MYT-1。按组别进行分类，则与对照组相比，R1组共有12种蛋白质表达发生变化，其中与线粒体功能相关的VDAC及ODPA表达下调，与髓鞘结构相关的MBP表达升高、MYT-1消失，与脊髓损伤后修复相关的HSP25新增表达;R2组共有7种蛋白质表达发生变化，其中包括与线粒体功能相关的VDAC及ODPA的表达下调，以及GS和TPIS的上调;R3组仅有2种蛋白质表达发生变化，即GFAP和ALDOA/C的升高，并且这种变化见于全部5个实验组;R4组共有5种蛋白质表达发生变化，其中脊神经修复相关的SIRT2特异性下调，与物质代谢相关的ALDR特异性增高;B组共有5种蛋白质表达发生变化，其中与髓鞘结构相关的MBP表达升高，与脊髓损伤后修复相关的HSP25新增表达。　　 结论：　　 1、与改良Yaksh法相比，改良后的经腰椎穿刺法对大鼠运动协调功能影响较小，置管途径更好地模拟了临床，因而更适合于局麻药及椎管内麻醉的相关研究。　　 2、1％的罗哌卡因多次注入大鼠蛛网膜下腔，造成其运动功能减退;注药24小时后脊髓超微结构病理改变明显;脊髓蛋白质中与线粒体功能及髓鞘结构相关的蛋白质变化明显;与脊神经修复相关的HSP25新增表达。　　 3、0.5％的罗哌卡因用于蛛网膜下腔，对大鼠行为学指标、脊髓超微结构及蛋白质组的表达均无显著影响。　　 4、由葡萄糖稀释的0.5％罗哌卡因用于大鼠蛛网膜下腔，24小时后其脊髓蛋白质中与脊神经修复相关的SIRT2特异性下调。　　 5、0.75％布比卡因用于大鼠蛛网膜下腔，24小时后大鼠脊髓超微结构病理改变明显;脊髓蛋白质中有HSP25新增表达，MBP表达上升。