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植物细胞内的蛋白运输是通过囊泡介导完成的。而在囊泡运输的过程中,囊泡拴系对囊泡与受体膜的特异性识别起着至关重要的作用。Exocyst是一个八亚基拴系复合体,主要调控外泌囊泡在质膜上的拴系过程。研究表明exocyst复合体参与到植物的生长发育和细胞形态建成过程中,包括胞质分离。Exocyst亚基SEC6,SEC8,EXO70A1和EX084B定位于细胞板,参与胞质分离的过程。但是它们是如何发挥作用,并不清楚。果胶甲酯化酶(PME,pectin methyles-terase)是植物中广泛存在的酶类,它能够通过改变植物细胞壁中果胶的甲酯化程度进而影响植物的生长发育。我们前期的酵母双杂交实验表明,SEC6和PME17互作,且PME17也定位于细胞板。本文以 exocyst 突变体(PRsec6,exo 70a1,exo70e2 和 exo84b)和 pro35S:PME17-GFP拟南芥转基因植株为材料,对拟南芥exocyst复合体在PME17定位中的功能进行了初步研究,发现PME17经外泌途径达到细胞壁及细胞板,SEC6亚基为PME17的细胞板定位所必需。这一研究表明exocyst复合体可能通过介导PME17等细胞壁结构调节蛋白的分泌来影响细胞板的形成,延伸和成熟。1.PME17定位于细胞壁和细胞板,并参与到整个细胞板形成过程通过构建pro35S:PME17-GFP拟南芥转基因植株观察发现PME 17定位于细胞壁,且在新成熟细胞板上的荧光信号十分强烈。通过FM4-64染色监控细胞的整个胞质分离的过程,发现PME17参与到细胞板的形成,延伸和成熟。2.Exocyst复合体亚基SEC6对PME17定位的调控具有特异性PME17是以SEC6为诱饵筛选拟南芥cDNA酵母文库得到的互作蛋白,本实验室通过酵母双杂,BiFC以及pull-down等实验证实了其互作的真实性。将PME17-GFP植株与PRsec6突变体杂交,观察其后代纯合体植株,我们发现SEC6亚基的缺失会导致PME17定位发生紊乱,使其荧光信号弥散在胞质中。为了探究SEC6对PME17定位调控是否具有特异性,我们观察了 PME17在其他exocyst突变体(exo70a1,exo 70e2和exo84b)背景下的定位情况。发现除了在exo84b背景下荧光大幅度减弱以外,PME 17的定位在这些突变体中并没有发生改变,说明SEC6对PME17定位的调控具有特异性。3.PME17的运输经过Golgi,TGN和PVC但不依赖于网格蛋白介导的内吞和细胞骨架观察PME17-GFP的亚细胞定位时发现其胞质中含有“点状”荧光信号。为探究这些“点状”信号的定位,我们将PME17-GFP转基因植株与本实验室已有的细胞器marker植株进行杂交。观察其后代双荧光标记植株,发现PME17能够与Syp32-mCherry(Golgi),Syp43-mCherry(TGN,trans-Golgi network)和RHAI-mCherry(PVC,prevacuolar compartment)良好的共定位。说明PME17的运输经过Golgi,TGN到达细胞壁。通过药物处理实验,PME17对布雷菲尔德菌素A(Brefildin A,BFA),刀豆素A(Concanamycin A,ConcA)敏感,进一步说明其共定位的真实性。此外,PME17对LY294002以及渥曼青霉素(Wortmannin,Wort)定位也能发生变化,这也证实了 PME17与PVC的共定位,说明PME可能经PVC分泌到细胞壁,也有可能经由PVC内吞至液泡进行降解。而经酪氨酸磷酸化抑制剂(TyrphostinA23),细胞松弛素D(Cytochalasin,CytD)和磺草硝(Oryzalin)处理后PME17的定位并没有发生变化,说明PME17的运输不依赖网格蛋白介导的内吞和细胞骨架。本研究表明,PME17是通过内膜系统运输至细胞壁以及细胞板上的,而SEC6亚基的缺失会导致其无法分泌至胞外,说明SEC6能够特异的将PME17募集到细胞壁上。