对虾样品常温保存液的筛选及核酸快速采集工具的制备

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:baronsong2009
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随着分子生物学技术在水产动物疾病诊断中应用的逐渐深入,动物组织中核酸的有效保存成为后续分子学研究的关键。一种安全、方便的水产动物样品保存液,将为水产动物样品采集及后续的分子研究提供方便。本论文以凡纳滨对虾为研究对象,以铵盐、乙醇为基础成份,通过不同的组合筛选一种常温下对凡纳滨对虾核酸有较好保存效果的保存液配方。将乙酸铵、甲酸铵、硫酸铵分别在0%、30%乙醇、50%乙醇和70%乙醇中溶解到饱和状态,添加EDTA和柠檬酸钠后调节pH(5.2、6.0、7.0)得到36种保存液。对凡纳滨对虾RNA溶液的保存实验结果显示,28℃下,70%乙醇为溶剂的饱和乙酸铵溶液和50%、70%乙醇为溶剂的饱和硫酸铵溶液保存3d回收的RNA28S和18S条带完整、界限清晰。在以上结果的基础上以不同浓度乙醇为溶剂,配制不同pH的硫酸铵和乙酸铵饱和溶液,测试其对凡纳滨对虾组织的渗透效应和对RNA在常温条件下的保护作用。结果表明,乙酸铵比硫酸铵在乙醇中的溶解度高的多,而且其铵离子的摩尔浓度在0—80%乙醇溶剂中比较稳定。乙酸铵比硫酸铵能更快渗透到整体的对虾组织中,并达到更高的浓度。硫酸铵在70%乙醇中的饱和溶液和乙酸铵在50%乙醇中的饱和溶液(pH6.0)保存的RNA条带完整清晰,保存效果较好,荧光定量PCR结果显示保存7d后硫酸铵在70%乙醇中的饱和溶液和乙酸铵在50%乙醇中的饱和溶液(pH6.0)中提取RNA的拷贝数下降均不超5倍,RNA半衰期都在2.5d以上。但综合考虑到硫酸铵在70%以上乙醇中的低溶解度和高浓度乙醇存在的安全隐患,我们最终推荐50%乙醇溶液中的饱和乙酸铵溶液(pH6.0)作为样品采集及常温保存的保存液。该结果为野外样品采集及常温运输提供一种有效方法。为探索一种可应用于现场快速采集核酸的简易工具,本论文以纤维素材料的木、竹牙签为基质,并分别经过氨基化处理和季氨基化处理,以FTA膜片为对照,吸取核酸溶液后分别用去离子水、TE buffer(pH8.0)、1PCR buffer进行洗脱回收。结果显示,70℃预热的TE buffer洗脱效果最好。对不同浓度核酸溶液和组织匀浆液的吸附试验结果显示不经化学改性的的竹牙签的回收效果及灵敏度与价格昂贵的FTA膜片差不多或者更好。最终推荐经过一定预处理的竹质牙签为核酸快速提取工具,以预热的TE buffer(pH8.0)为洗脱buffer应用到现场核酸快速采集中。
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