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目的:通过体外贴壁培养研究广西眼镜蛇蛇毒活性蛋白之一的神经生长因子(NGF)对软骨细胞的影响以明确其对软骨细胞的作用,并进一步联合胶原水凝胶载软骨细胞构建仿生材料及对其特性进行考察。为软骨缺损的软骨组织工程治疗和研究打下基础及提供素材。方法:(1)软骨细胞的获取和鉴定:利用二次改良消化法从新西兰乳兔的关节软骨中分离出兔软骨细胞,并将其进行培养和传代。通过倒置显微镜观察原代及传代细胞的形态,MTT法观察其生长趋势,甲苯胺蓝染色以及PCR进行监测各代兔软骨细胞细胞学特性,从中获得生长旺盛、表型良好的软骨细胞。(2)蛇毒NGF对体外二维培养中软骨细胞作用的实验:先行蛇毒活性蛋白NGF的细胞毒性分析,再从中选取效果相对明显的浓度(35,70,140 ng//ml)和空白对照组进行干预。2,4,6天后分别行DNA含量,糖胺多糖(GAG)/DNA测定,HE染色,Ⅰ型和Ⅱ型胶原染色以及PCR检测软骨相关基因(collagen Ⅱ,aggrecan,sox 9,conllagen Ⅰ,collagen X)表达水平。(3)蛇毒NGF在三维软骨模型中的考察:利用胶原基水凝胶复合兔关节软骨细胞制备体外软骨三维模型。将实验分为空白对照组,NGF组(70 ng/ml NGF),阳性对照组(10 ng/l TGF-ê)。于干预后的 7,14,21天分别行DNA含量,GAG/DNA测定,HE染色,Ⅰ型和Ⅱ型胶原染色,PCR检测软骨相关基因(collagen Ⅱ,aggrecan,sox 9,conllagenⅠ,collagen X)表达水平以及进行生物力学检测。结果:(1)兔关节软骨细胞的提取、培养和鉴定:利用二次改良消化法分离的新西兰乳兔膝关节软骨细胞24-36h贴壁。原代细胞呈梭形或三角形,胞体较小。随着到传代,细胞增殖P3以内速度加快,P3以后逐渐减缓,形态也渐由典型的三角形、多角形变成长梭形,甲苯胺蓝染色逐渐减弱。PCR结果表明Ⅱ型胶原随着传代的增多而减少,Ⅰ型胶原则相反。第3代的软骨细胞形态典型、纯度好、增殖旺盛、分泌功能强,适用于本实验后续研究。(2)蛇毒NGF对软骨细胞作用的实验:细胞毒性分析0-280 ng/ml无明显细胞毒性,其中17.5-240ng/ml能够促进软骨细胞的增值。DNA含量检测显示实验组NGF能促进软骨细胞增殖(P<0.05)和细胞活力,HE染色显示各组之间细胞形态无差,GAG/DNA、免疫组化和PCR也表明其能促进软骨相关基质和胶原的表达和分泌。其中以其浓度为70 ng/l时效果最好。(3)蛇毒NGF在三维软骨模型中的考察:生物力学测试实验开始前和后仿生弹性模量无明显改变(P>0.05)。DNA含量检测显示蛇毒活性蛋白NGF促进软骨细胞增殖和维持细胞活力与TGF-β相当(但除外DNA含量21天时点NGF组比TGF-β组高,P<0.05),皆比空白组强(P<0.05);HE染色显示各组之间细胞形态无差;GAG/DNA、免疫组化和PCR也表明其促进软骨相关基质和胶原的表达和分泌与TGF-ê相当(但除外col2基因表达量21天时点NGF组比TGF-β组高,P<0.05),皆比空白组强(P<0.05)。结论:二次改良消化法能够提取到纯度高,数量多,表型良好的兔关节软骨细胞,而蛇毒活性蛋白NGF对其体外增殖及维持细胞表型有良好的作用,其作用效果在体外构建类软骨组织的仿生材料中亦确切。