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目的 肝脏是机体产热的重要器官,参与体温调节。近年来,肝脏在体温调节方面的作用日益受到重视。但到目前为止,关于iNOS在肝脏的生理和病理状态下所起的作用却少有研究。因此,本实验从上述问题着手,基于NO广泛的生理和病理作用,研究细菌脂多糖引起的内毒素性发热中,iNOS在大鼠肝脏中的表达,从而进一步探讨iNOS在体温调节中的作用。 实验方法 方法:(1)测量体温:在实验前3天每天让动物在实验环境中适应3小时,大鼠放在特制的鼠笼内,将测温探头插入大鼠直肠内8cm,第4天进行发热实验。实验室温度控制在20-24℃。用无热原生理盐水将脂多糖稀释成100μg/ml,实验时按1mg/kg剂量给大鼠腹腔注射。体温测量时,将大鼠放在特制的鼠笼内,将测温探头插入直肠内8cm,并用胶布固定于尾根部,待体温恒定后测三次体温(每次间隔10min)以其均值作为基础体温。然后各组注射相应药物,以后每间隔1小时记录一次体温,直至实验结束。为了避免生物节律的影响,每次实验均在上午8时30分开始,采用分批交叉进行各组实验。(2)免疫组织化学技术:将大鼠用20%氨基甲酸已酯5ml/kg腹腔注射麻醉,灌流固定,取肝组织迅速置于含4%多聚甲醛的PBS液(0.01mol/L,Ph7.4),固定6小时,再移入15%的蔗糖磷酸缓冲液中4℃过夜,准备切片。次日将标本用OCT包埋,恒冷切片机温度调到-20℃,行10μm冰冻切片。用3%H。O。室温下处理切片10min;用5%正常羊血清室温下处理3o而n;在每张切片上滴加50…一抗PB液(效价1:ppL4℃下过夜。次日,每张切片依次滴加生物素标记的羊抗兔IgG(效价 1:10o乃7℃30ruin;滴加辣根酶标记链霉卵白素37℃30dn。然后将新鲜配制的DAB显色剂滴于标本上,显色10min,充分水洗后,苏木素复染。常规剃度脱水,树胶封片。使用显微图象分析技术,测定iNOS阳性反应产物的整合光密度值、%阳性面积、平均灰度值。所有数据以均值。标准差k土S)表示,统计分析使用多样本均数方差分析进行显著性差异的比较。 结 果 LPS发热组在腹腔注射LPS后体温逐渐的升高,在注射后6小时达到最高值,体温升高1.38℃,明显高于对照组u<o.01厂而后逐渐下降,在注射LPS后9小时大鼠的体温仍高于对照组P<o.01人口s发热组在升高体温的同时,也有效的增高肝脏内mOS活性,与对照组比较,差异非常显著河<O.*1人切片经免疫组织化学反应oAB染色后,可在光镜下观察到iNOS阳性产物呈棕褐色,主要分布在枯否细胞、胆管内皮细胞、噬酸粒细胞等细胞的胞浆中,在肝细胞膜上也可见iNOS阳性产物。采用显微图象分析系统测定iNOS阳性产物的整合光密度值、平均灰度值、%阳性面积。其中 LPS发热组3,6,gb iNOS阳性产物的整合光密度值与%阳性面积均高于正常对照组iNOS的整合光密度值和%阳性面积(P<o.0门,且以LPS发热组6h的整合光密度值及防阳性面积为最大。平均灰度值则相反,LPS发热组3,6,gb的平均灰度值较对照组比较均有减少汗<O对门,以LPS发热组6h的值为最小。将LPS发热组的体温变化与肝脏组织中iNOS活性变化做相关分析,结果表明二者之间存在正相关关系p<o.01人 ·2· 结 论 1.LPS诱导肝脏组织广泛iNOS阳性反应产物,并在大鼠注射LPS后6小时iNOS阳性反应产物最多。 TiNOS在肝细胞阳性反应产物主要分布在肝细胞膜。 3.LPS诱导的体温升高和肝脏中iNOS活性增高存在正相关关系,肝脏内iNOS参与体温调节。