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湖泊富营养化和蓝藻水华频繁暴发是当前国内外迫切关注的生态问题,藻细胞破裂时会向水体中释放大量的次生代谢物——微囊藻毒素(microcystins,MCs),对水生动物乃至人类产生显著的致毒作用。大量研究表明,MCs不但是典型的肝毒素,更会对机体生殖系统造成严重的损伤。为了系统地评估MCs对鱼类的生殖毒性并探究其致毒机制,本研究分别选取模式生物斑马鱼(Danio rerio)及斑马鱼第Ⅲ期卵母细胞(in vitro)作为实验材料,首先采用浸泡暴露方式,探究微囊藻毒素microcystin-LR(MC-LR)对性成熟雌性和雄性斑马鱼性腺的病理损伤及配子发育的干扰作用,并从下丘脑-垂体-性腺(hypothalamic-pituitary-gonad,HPG)轴上相关基因和蛋白的表达水平、血清中性激素含量及斑马鱼生殖机能等方面,系统分析MC-LR对性成熟雌性和雄性斑马鱼的生殖内分泌系统的干扰作用;开展繁殖实验,收集经MC-LR处理30 d后的性成熟雌性和雄性斑马鱼的胚胎,于清水中饲养,通过研究子代幼鱼的生长发育、相关基因转录水平、氧化应激以及肝脏组织病理变化,探究MC-LR通过母体传递对子代幼鱼的毒性作用;最后采取卵母细胞体外培养技术,结合丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)相关亚型抑制剂,探究MC-LR对斑马鱼卵母细胞中蛋白磷酸酶(protein phosphatase)PP2A活性、MAPK关键蛋白磷酸化水平以及卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)率的影响,评估MC-LR对卵母细胞体外成熟进程的干扰作用;本研究从亲本、配子、子代3个方面开展,全面系统地探究MC-LR对鱼类的生殖毒性作用,为揭示MC-LR的致毒机制提供重要的实验依据。主要结果如下:1.在斑马鱼在体实验中,分别以性成熟雌性和雄性斑马鱼为实验对象,对其进行为期30 d的浸泡暴露实验,MC-LR剂量为1、5、20μg/L,研究结果显示:开展繁殖实验,发现MC-LR处理可显著降低雌鱼的产卵量,5μg/L和20μg/L的MC-LR处理组的受精率显著下降,子代幼鱼(0-5 dpf)的死亡率仅在高剂量20μg/L MC-LR处理组中显著增加,表明MC-LR处理后斑马鱼的生殖机能受到了不利影响;MC-LR处理后,雌鱼和雄鱼的体指数(K)及脑指数(BSI)无明显变化,雄鱼性腺指数(GSI)在所有处理组中均显著降低,而雌鱼的GSI仅在20μg/L MC-LR处理组中显著降低;此外,各处理组的雌鱼和雄鱼的性腺组织均表现出不同程度的组织病理学改变,如空泡化、细胞间隙扩大、细胞溶解等,表明MC-LR对斑马鱼的卵巢和精巢组织造成了直接损伤;MC-LR处理后,雌性和雄性斑马鱼的配子发育均受到了干扰,且卵子发育对MC-LR更为敏感;血清中垂体激素促卵泡生成素(FSH)和黄体生成素(LH)及性激素雌二醇(E2)、睾酮(T)、11-酮基睾酮(11-KT)均表现出不同程度的改变,揭示了MC-LR的内分泌干扰作用;斑马鱼经MC-LR处理后,检测到HPG轴相关基因的m RNA水平及关键蛋白表达水平的改变,表明MC-LR可能通过破坏HPG轴稳态来发挥其生殖毒性作用。2.对性成熟雌性和雄性斑马鱼进行为期30 d的MC-LR(剂量为1、5、20μg/L)浸泡暴露,配对繁殖获得子代胚胎,并将其置于清水中饲养至受精后60 d,研究结果显示:亲本斑马鱼经MC-LR处理30 d后,可在雌鱼卵巢中检测到较高含量的MC-LR,具有显著的毒物富集效应,且富集量与暴露剂量呈现正相关;经5μg/L和20μg/L的MC-LR处理后的亲本所产子代斑马鱼,其体指数显著下降,表明其生长发育受到显著抑制;亲本斑马鱼经MC-LR处理后,子代幼鱼的相关基因(gh、ghr、igf、igfr)表达水平显著下调;此外,MC-LR处理组的子代幼鱼的肝脏组织呈现不同程度病理损伤,如肝细胞排列疏松、出现空泡化、部分细胞的胞质缺失等。本研究表明,MC-LR可在卵巢中富集,并能通过母体传递的方式对子代幼鱼生长发育产生毒性作用。3.在离体实验中,以斑马鱼卵母细胞(in vitro)为实验材料,进行MC-LR(1、10、100μg/L)的暴露处理,并分别添加3种MAPK抑制剂(10μM)以测定MC-LR暴露对各MAPK亚型蛋白的作用效果,研究结果表明:体外培养卵母细胞经MC-LR暴露2 h和4 h后,10μg/L和100μg/L MC-LR处理组中PP2A全酶活性显著下调,MC-LR暴露2 h后MAPK各亚型的磷酸化水平无显著变化,而卵母细胞经100μg/L的MC-LR处理4 h后,其ERK、p38和JNK通路被激活,同时卵母细胞的GVBD率显著升高;ERK抑制剂U0126和p38抑制剂SB203580可显著减缓100μg/L MC-LR所诱导的MAPK过磷酸化及GVBD提前发生的作用,而JNK抑制剂SP600125的效果并不显著。本研究表明MC-LR可通过抑制PP2A活性,激活MAPK信号通路,特别是ERK和p38通路,从而干扰卵母细胞减数分裂恢复的正常进程,揭示了微囊藻毒素干扰配子发育的分子机制。