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猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PRV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)。作为重要病原之一,猪轮状病毒在全世界各个养猪国家引起了仔猪病毒性腹泻。由猪轮状病毒所引起的病毒性感染无论是单独感染或者交叉感染在猪群中均普遍存在,由此造成仔猪的患病甚至死亡给猪养殖业造成了巨大的经济损失。猪轮状病毒外衣壳蛋白主要由VP8与VP7组成,VP8与VP7是猪轮状病毒外膜上的主要中和抗原,能够刺激机体产生体液免疫和黏膜免疫,从而激发机体的免疫保护作用,因此具有以VP8与VP7为基础研制抗猪轮状病毒疫苗的潜力。蛋白转导结构域(Protein Transduction Domains,PTD)是一类分子量一般小于20个氨基酸的多肽,在多数情况下也被称为细胞穿膜肽(Cell Penetrating Peptides,CPPs)。研究表明,穿膜肽具有能够携带多种物质,如蛋白、核酸、纳米颗粒、多肽等物质越过细胞屏障而进入细胞的能力。TAT属于PTD成员,是HIV-1中的一个转录激活因子,该蛋白中包含一个11个氨基酸序列的短肽,该短肽能够介导与之相连的外源物质穿过细胞屏障,进入多种组织中。本研究人工合成重组基因VP8-VP7-TAT基因片段,将其连接至pGEX-6p-1表达载体。以测序正确质粒为模板,PCR扩增获得的VP8-TAT、VP7-TAT,连接至pGEX-6p-1表达载体,由此构建了重组质粒pGEX-VP8-VP7-TAT、pGEX-VP8-TAT、pGEX-VP7-TAT。将重组质粒 pGEX-VP8-VP7-TAT、pGEX-VP8-TAT、pGEX-VP7-TAT 分别转化 EschierichiacoliBL21(DE3),构建了含有VP8-VP7-TAT的大肠杆菌基因工程菌株E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)、含有VP8-TAT的大肠杆菌基因工程菌株Ecoli BL21(DE3)(pGEX-VP8-TAT)和含有VP7-TAT的大肠杆菌基因工程菌株E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP7-TAT)。该基因工程菌株经IPTG诱导表达,分析结果显示:E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-VP7-TAT)、E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP8-TAT)、E.coli BL21(DE3)(pGEX-VP7-TAT)经诱导表达和纯化后分别获得融合蛋白VP8-VP7-TAT、VP8-TAT 和 VP7-TAT。三种融合蛋白 VP8-VP7-TAT、VP8-TAT和VP7-TAT分子量与预期大小59.9kDa、56.3kDa和31.4kDa相符合。经Western Blot试验证明,该三种融合蛋白均可以和抗-GST抗体发生特异性反应。采用纯化的融合蛋白VP8-VP7-TAT、VP8-TAT、VP7-TAT分别以腹腔注射和灌胃的方式免疫小鼠,间接ELISA方法分别检测血清中特异性IgG抗体及粪便黏膜IgA抗体。结果显示,融合蛋白VP8-VP7-TAT经注射或灌胃免疫小鼠后,能够有效诱导小鼠机体产生体液免疫应答,并且融合蛋白VP8-VP7-TAT经灌胃可诱导小鼠机体产生较强的黏膜免疫应答。融合蛋白VP8-VP7-TAT相较VP8-TAT、VP7-TAT,能诱导小鼠机体产生更强的免疫应答,具有更强的免疫原性。融合蛋白VP8-VP7-TAT的穿肠实验结果表明,融合蛋白VP8-VP7-TAT具有穿肠活性。融合蛋白VP8-VP7-TAT经小鼠安全性实验表明具有很好的安全性。本研究为猪轮状病毒(PRV)口服疫苗的研究提供了一种新的思路。