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单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)在自然界中广泛分布,被世界卫生组织(WHO)列为四大食源性病源体之一。L.monocytogenes可以粘附在食品加工设备及储存容器上,形成生物膜后污染食品,从而造成严重的食品安全问题。因此,本论文选用了L.monocytogenes作为主要参试菌,深入研究了天然抗菌剂丁香精油(Clove essential oil,CEO)对其游离菌和生物膜的抗菌效果和作用机制。对游离菌的抗菌机制研究包括精油对L.monocytogenes的抗菌活性,对三种胞内大分子物质含量及两种胞内关键酶活性的影响,对呼吸代谢的主要抑制途径以及其主成分丁香酚与DNA间的作用方式。在此基础上,进一步探究了CEO对生物膜的抑制机制,分别测定了CEO对几个生物膜形成关键调控因素的影响,包括细胞早期运动能力、胞外基质(蛋白质、多糖、DNA)分泌以及L.monocytogenes生物膜形成有关基因agr操纵子各基因、毒力调控因子的调控基因prfA和压力应答因子的调控基因sigB的表达量水平。最后将CEO应用于蔬菜和不同容器材料表面,并对其实际应用效果进行了评估。主要研究结果如下:(1)CEO对L.monocytogenes的抑菌活性显著。MIC和MBC分别是0.5mg/mL和1.0 mg/mL,MIC浓度作用8 h后菌体致死率为99.999%。由TEM图得出,精油作用后菌体细胞表面现出褶皱、凹陷,细胞膜破损,造成细胞内物质的渗漏。进一步验证发现精油作用后,三种细胞内生物大分子(蛋白质、ATP、DNA)含量和两种胞内关键酶(β-半乳糖苷酶和AKP酶)的表达活性受到抑制。(2)CEO对L.monocytogene呼吸代谢的主要抑制途径是TCA途径。精油作用后TCA途径中三种关键酶(CS、α-KGDH、ICDHm)的活性均受到抑制。分析TCA循环相关代谢产物含量变化得可知精油作用后TCA循环减弱。除此之外,CEO主成分丁香酚可以与菌体DNA发生嵌合作用。(3)CEO对L.monocytogenes生物被膜具有良好的清除作用。MBIC和MBEC分别为1.0 mg/mL和2.0 mg/mL,4MBIC的CEO处理生物被膜8 h后清除率高达99.99%。TEM和CLSM观察得精油会破坏菌体致密的膜结构,从而作用于释放的游离菌降低其活性甚至使其失活。(4)CEO抑制了生物膜内细菌的代谢活性。2MBIC浓度的CEO作用后,生物膜内60.26%的细菌失去了代谢活性。CEO作用后细菌聚集能力降低,丛集运动范围减小,从而对生物膜形成初期产生抑制。(5)L.monocytogenes EDG-e生物膜胞外基质中,蛋白质、eDNA和多糖含量依次减少。2MBIC浓度的CEO处理后,胞外多糖的蛋白质的分泌量分别下降了88.34%和75.61%。此外,CEO对eDNA的分泌量无显著影响。(6)CEO影响了L.monocytogenes EDG-e生物膜形成相关基因的表达。MIC浓度的精油作用后,agrA,agrC和agrD的表达量分别降低了92.44%,90.18%和56.60%,而agrB基因的转录水平无显著改变。基因sigB的表达量上调了2.37倍。基因prfA的表达量降低了84.33%。(7)应用研究显示,CEO对不同容器材料和蔬菜表面L.monocytogenes生物膜均表现出显著的清除效果,且通过感官评价实验表明,精油并不会破坏蔬菜的品质与原有风味。