【摘 要】
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目的:脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）是几乎所有革兰氏阴性细菌的主要表面膜成分,也是内毒素的主要化学成分。LPS剂量依赖的细胞毒性作用可导致心肌损伤。桃叶珊瑚苷（aucubin,AUB）是从杜仲种子中分离得到的环烯醚萜苷。以往研究证实AUB具有抗炎和抗凋亡等生物活性,但其对LPS诱导的急性心肌损伤的作用仍未阐明。本实验目的为研究AUB通过调节核苷酸结合寡聚化结构域（nucl
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目的:脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）是几乎所有革兰氏阴性细菌的主要表面膜成分,也是内毒素的主要化学成分。LPS剂量依赖的细胞毒性作用可导致心肌损伤。桃叶珊瑚苷（aucubin,AUB）是从杜仲种子中分离得到的环烯醚萜苷。以往研究证实AUB具有抗炎和抗凋亡等生物活性,但其对LPS诱导的急性心肌损伤的作用仍未阐明。本实验目的为研究AUB通过调节核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide binding oligomerization domain,NOD）样受体家族吡咯结构域3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3）炎症小体对LPS诱导心功能不全的保护作用,并探讨其分子机制,为治疗脓毒症性心肌病提供理论依据。方法:本试验将无特定病原体（Specific Pathogen Free,SPF）级雄性C57BL/6J小鼠分为四组（n＞6）:生理盐水+假手术组（Sham组）;生理盐水+LPS组（LPS组）;AUB低浓度+LPS组（AUB LD+LPS组）;AUB高浓度+LPS组（AUB HD+LPS组）。将NLRP3敲除小鼠（NLRP3-KO）分为四组:NLRP3-KO组;NLRP3-KO+AUB组;NLRP3-KO+LPS组;NLRP3-KO+LPS+AUB组。对C57BL/6J和NLRP3-KO小鼠进行AUB LD 1mg/kg/天或AUB HD 5mg/kg/天预处理7天,在AUB处理的最后一天对小鼠进行一次性腹腔注射LPS 6mg/kg,从而诱导急性心肌损伤模型。造模结束后对各组小鼠进行心功能的检测,然后取材并进行分子生物学和病理学检测。RT-PCR检测炎症因子如白细胞介素-1（IL-1）和白细胞介素-6（IL-6）等和氧化应激标志物如超氧化物歧化酶（SOD）和gp91phox等。Western blot检测氧化应激标志物如SOD和硫氧还蛋白（TXNIP）,凋亡相关蛋白如B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）,细胞色素C（Cytochrome C）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 Associated X Protein,Bax）和炎症相关通路（TXNIP/P65/NLRP3）的检测。免疫组化、免疫荧光染色,PSR染色,末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP生物素缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP-biotin nick end labeling,TUNEL）染色和氧化应激试剂盒对上述炎症、氧化应激和凋亡相关指标进行检测,以综合评价AUB对LPS诱导心肌损伤发挥保护作用。此外,培养大鼠原代心肌细胞,H9C2心肌细胞进一步验证AUB在体外发挥保护作用。结果:1.AUB明显减轻LPS诱导的H9C2心肌细胞和原代大鼠心肌细胞炎症反应（IL-1,IL-6和TNFαm RNA水平的降低;P＜0.05）,氧化应激反应(SOD m RNA表达增加,gp91phox和P67 m RNA水平降低,SOD活性升高,NADPH活性和MDA表达降低,ROS表达降低;P＜0.05),和凋亡（凋亡细胞减少,Bax和cytochrome C蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高;P＜0.05）。2.AUB明显改善LPS诱导的小鼠心肌功能不全,表现为左室射血分数升高（47±5.8 vs.51±4.8;P＜0.05）和左室短轴缩短率升高（22±2.5 vs.23±2.7;P＜0.05）。3.AUB显著改善LPS诱导C57/B6J小鼠心肌炎症反应（IL-1,IL-6和TNFαm RNA水平的降低;CD45和CD68表达降低;P＜0.05）,氧化应激(SOD m RNA表达增加,gp91phox和P67m RNA表达降低;4-HNE表达降低,SOD蛋白表达增加,Thioredoxin,P67和gp91phox蛋白表达水平降低;P＜0.05),和凋亡（心肌细胞凋亡数减少,凋亡相关蛋白Bax和cytochrome C表达降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加;P＜0.05）。4.AUB通过调控TXNIP/P65/NLRP3信号通路对LPS诱导的心肌炎症,氧化应激和凋亡发挥保护作用。5.心肌细胞过表达NLRP3可减轻AUB的心肌保护作用。6.与野生型小鼠相比,NLRP3敲除鼠的心功能,心肌炎症反应,氧化应激反应和凋亡得到明显改善。7.ROS抑制剂NAC发挥与AUB相同的抗炎抗氧化应激作用。NF-κB抑制剂BAY117082发挥与AUB相同的抗炎作用。结论:AUB通过依赖NLRP3炎症小体对LPS诱导的心功能不全发挥保护作用。因此,AUB可能是治疗脓毒性心肌病的一个潜在治疗靶点。
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