人参锈腐病是人参生产上最为严重的根部病害之一,亦称为“人参癌症”,该病害发生范围广、周期长、危害严重,难于防治,严重影响人参的产量和品质。甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)NJ13菌株是本课题组从人参茎部分离筛选到的对人参锈腐病具有较好生防效果的内生细菌。经过前期研究发现,NJ13生防菌株可以产生抗菌蛋白类物质,通过产生胞外蛋白而发挥抑菌作用。在NCBI基因数据库中对测得的蛋白质序列进行了Blastp比对,结果显示与蛋白酶和草酸脱羧酶的相似性较高。本研究在此基础上对NJ13菌株抗菌蛋白基因进行了克隆及敲除载体的构建。在已公布的B.methylotrophicus模式菌株JS25R(CP.009679.1)基因组序列中,选取对应蛋白的序列并设计带有BmaHΙ和SalΙ酶切位点的引物,以NJ13菌株基因组为模板,成功克隆了2个肽酶基因,分别命名为Bm-pe-1,Bm-pe-2,2个草酸脱羧酶基因,分别命名为Bm-oxdc-1和Bm-oxdc-2,并采用DNAMAN、Swiss model和ExPAsy软件对基因序列进行了分析及结构功能预测;将克隆到的基因在大肠杆菌中进行了原核表达,制备粗蛋白样品,SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳检测后,显示Bm-pe-2基因表达产物在分子量66.4KDa处出现了特异性条带,而对照没有产生,表明该肽酶基因已在大肠杆菌BL21中成功表达,但该表达产物是否与之前纯化测序的蛋白一致,且是否具有抑菌活性还有待进一步确认;根据同源重组原理,构建了4个克隆基因的敲除载体pk18mobsacb-P1(P2/O1/O2)-Gm,为抗菌蛋白基因功能的验证奠定基础。通过本研究期望能够发掘到抗菌蛋白编码基因,明确其功能,为丰富生防芽孢杆菌活性产物及编码基因多样性,提高生防效果,构建和改良工程菌株奠定基础。