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目的:本项目采用“预测-确认”的液质联用分析策略,建立一种对苦丁茶皂苷类成分靶标分析方法,对苦丁茶皂苷类成分进行鉴定和表征,明确苦丁茶降血脂物质基础成分。采用超高效液相串联高分辨飞行时间质谱（UltraHigh Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time of flight-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry,UHPLC-QTOF-MS/MS）技术,定性和定量分析血清低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein,LDL）脂质微环境中磷脂类成分,并根据清道夫受体（Scavenger Receptor,SR）相关基因的表达情况,初步阐明苦丁茶皂苷防治高脂血症的药效及作用机制。根据现代药剂学理论的纳米剂型相关技术,确定了苦丁茶皂苷纳米微球制剂处方及工艺,对其进行表征及药效学、药代动力学评价,为苦丁茶皂苷防治高脂血症的临床应用和进一步开发利用提供科学依据。方法:试验一苦丁茶皂苷类成分的鉴定研究1.采用水煮法提取海南苦丁茶（Ilex kudingcha C.J.Tseng）以获得苦丁茶水提物,采用HP20SS树脂分离苦丁茶水提物以获得苦丁茶皂苷部位。2.根据文献调研,总结苦丁茶皂苷类成分的裂解规律,采用“预测-验证”的分析策略,预测潜在存在的苦丁茶皂苷类成分,建立潜在苦丁茶皂苷化合物库。3.使用UHPLC-QTOF-MS/MS技术,对苦丁茶皂苷类成分进行表征。试验二苦丁茶皂苷防治高脂血症的药效学及作用机制研究1.使用高脂饲料建立高脂血症的金黄地鼠模型,苦丁茶皂苷灌胃给药,采用试剂盒测量血清各生化指标。2.使用UHPLC-QTOF-MS/MS分析,建立高脂血症动物血清溶血甘油磷脂（Lysoglycerophospholipid,Lyso-GPL）类成分轮廓谱。3.采用琼脂糖凝胶电泳分离高脂血症动物血清脂蛋白,根据上述建立的方法对血清脂蛋白脂质微环境中Lyso-GPL类成分进行定性和相对定量分析。4.采用实时定量逆转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）技术测定高脂血症动物肝脏SR相关基因表达情况。基于相关性、多元统计分析方法进行分析,研究SR基因表达的相关性,筛选苦丁茶皂苷防治高脂血症的潜在生物标记物。试验三苦丁茶皂苷纳米微球的制备及其药效学、药动学研究1.通过单因素实验结合响应面Box-Behnken设计优化实验,根据模型拟合结果筛选壳聚糖-苦丁茶皂苷纳米微球制剂最佳制备工艺及处方。2.对制备的壳聚糖-苦丁茶皂苷纳米微球制剂进行理化性质的表征,比较壳聚糖-苦丁茶皂苷纳米微球制剂与苦丁茶皂苷降血脂作用。3.建立苦丁茶皂苷类成分的体内含量测定方法,比较壳聚糖-苦丁茶皂苷纳米微球制剂与苦丁茶皂苷的药动学差异。结果:试验一苦丁茶皂苷类成分的鉴定研究1.采用HP20SS树脂通过60%乙醇水溶液（V/V）洗脱苦丁茶水提物获得了苦丁茶皂苷部位。2.建立了包含1881个不同分子量的苦丁茶皂苷潜在化合物库。3.通过自动匹配和手动验证,最终表征了80种苦丁茶皂苷类成分,包括11种首次在苦丁茶中发现的皂苷化合物,其中包括9种新化合物。试验二苦丁茶皂苷防治高脂血症的药效学及作用机制研究1.建立了高脂血症的金黄地鼠模型,模型组血清TC、LDL-C水平较正常组显著升高,HDL-C水平显著降低。各给药组血清TC,LDL-C和HDLC水平被回调。2.成功建立了包含高脂血症动物血清338个Lyso-GPL类成分的轮廓谱,其中包括189种Lyso-PC,58种Lyso-PE,22种Lyso-PS,33种Lyso-PA,28种Lyso-PI,8种Lyso-PG。3.利用上述建立的方法对琼脂糖凝胶电泳分离的血清脂蛋白脂质微环境中Lyso-GPL类成分定性和相对定量分析,结果表明,与正常组相比,高脂金黄地鼠血清脂蛋白中Lyso-GPL的总含量有增加的趋势。此外,正常组总Lyso-GPL的含量在HDL明显高于LDL。相反,在模型组中,HDL上的总Lyso-GPL含量明显低于LDL。4.对高脂血症动物肝脏SR相关基因进行RT-q PCR分析,结果表明,与正常组相比,模型组肝脏SR相关的基因（SR-A1,SR-B2和CD36）的表达水平显著升高,经苦丁茶皂苷给药,各SR相关基因的表达水平下降。通过正常组、模型组及苦丁茶皂苷给药组血清脂蛋白脂质微环境中Lyso-GPL类成分含量与SR相关基因表达情况的相关性、多元统计分析,最终筛选确定了4个Lyso-GPLs（16:1/Lyso-PC,18:4/Lyso-PC,Lyso-PC/18:1,22:7/Lyso-PE）作为苦丁茶皂苷防治高脂血症机制的潜在生物标记物。试验三苦丁茶皂苷纳米微球的制备及其药效学、药动学研究1.通过单因素实验并结合响应面Box-Behnken设计,根据模型拟合结果筛选出壳聚糖-苦丁茶皂苷纳米微球制剂最佳制备工艺及处方:壳聚糖浓度为2.0 mg·m L-1,苦丁茶皂苷浓度为0.5 mg·m L-1,三聚磷酸钠浓度为1.0mg·m L-1,加入速度为4 m L·min-1,搅拌速率1200 r·min-1,剪切时间45 min,溶胀时间为6 h。2.壳聚糖-苦丁茶皂苷纳米微球制剂进行了理化性质为:PdI为0.192,粒径为193.6 nm,Zeta电位为26.3 m V,载药量为8.65%,包封率为72.07%,透射电镜观察到有近似球形的外观。比较了苦丁茶皂苷原药及其纳米微球的降血脂药效学评价,发现纳米微球制剂具有更好的降血脂作用。3.建立了苦丁茶三种主要皂苷的体内含量测定方法,基于此进行了壳聚糖-苦丁茶皂苷纳米微球制剂体内药动学研究,经灌胃壳聚糖-苦丁茶皂苷纳米微球混悬液后,苦丁茶皂苷纳米制剂达峰时间（1.5 h）早于灌胃原型药（2.0 h）,其消除半衰期t1/2（2.0 h）比原型药（1.2 h）大,AUC面积（6507 ng·h·m L-1）大于原型药（4242 ng·h·m L-1）,提示壳聚糖-苦丁茶皂苷纳米微球制剂的生物利用度与苦丁茶皂苷生理盐水溶液相对较高。结论:本课题运用UHPLC-QTOF-MS/MS技术对苦丁皂苷部位的化学成分进行了鉴定与表征,并采用高脂血症动物模型对其降血脂活性进行了确证,利用实时定量RT-q PCR技术比较了各组清道夫受体相关基因表达水平,通过建立的血清脂蛋白溶血磷脂类成分轮廓谱,筛选了反映高脂血症病程的Lyso-GPL类生物标志物,初步阐明了苦丁茶皂苷降血脂的作用机理。确定了壳聚糖-苦丁茶皂苷纳米微球制剂制备工艺,在动物体内进行的药动学研究也进一步证实了壳聚糖-苦丁茶皂苷纳米微球制剂可以提高生物利用度,其降血脂效果相对更佳。本课题研究成果将为苦丁茶皂苷防治高脂血症的临床应用和进一步开发利用提供科学依据,并从改善血清脂蛋白脂质微环境的角度为防治高脂血症类疾病中药的研究提供了一个新的科学视角。