论文部分内容阅读
目的建立一种能同时测定附子中乌头碱、次乌头碱和新乌头碱含量的HPLC分析方法;研究生附子和制附子的HPLC指纹图谱;筛选适合附子生物转化的微生物;采用HPLC-MS法对转化后产生的新物质进行结构鉴定;通过药理、药效学试验对生物转化后的附子进行减毒增效研究。方法①以乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品作为对照,采用反相高效液相色谱法同时测定附子中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的含量。②参照中药注射剂质量控制中所采用的指纹图谱技术,分别对10批生附子、10批制附子以及生附子与制附子之间的HPLC图谱进行相似度比较,建立生附子及制附子的HPLC指纹图谱。③选用生附子粉为原料,采取固态发酵的方式,以菌种生长状况、双酯型生物碱含量以及新物质的产生与否作为评价指标,对附子生物转化所需菌种进行筛选。④采用HPLC-MS法对生物转化后附子中新增产物的结构进行初步鉴定,并通过动物实验对其减毒增效作用进行验证和评价。结果①试验建立的色谱条件,能同时准确测定附子中乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的含量。乌头碱进样量在0.17~2.72μg范围内与峰面积线性关系良好,线性回归方程为y=195555x-11910,R~2=0.9995;次乌头碱进样量在0.13~2.08μg范围内与峰面积线性关系良好,线性回归方程为y=335727x-16744,R~2=0.9996;次乌头碱进样量在0.15~2.40μg范围内与峰面积线性关系良好,线性回归方程为y=375160x-20194,R~2=0.9996。三者的平均加样回收率分别为100.04%、99.99%、100.09%。方法学考察表明,该法简单、准确、稳定可靠。②采用国家药典委员会颁布的“中药指纹图谱相似度评价系统2004版A”计算10批生附子及10批制附子HPLC图谱的相似度,结果表明,建立的指纹图谱方法可靠,可以作为附子指标检测和质量控制的方法。③以菌种生长情况、双酯型生物碱含量以及新物质的产生与否作为评价指标,对附子生物转化所需菌种进行筛选,结果表明,霉菌类菌种在附子的生物转化过程中生长状况良好,双酯型生物碱含量增加,新生物质个数较多、含量较高且比较稳定;细菌类菌种在附子的生物转化过程中菌种生长状况较差,双酯型生物碱含量变化不大,产生的新物质个数少、含量低且不稳定。故选取霉菌中的黑曲霉作为生物转化菌种对附子的生物转化进行初步研究,经黑曲霉生物转化后的附子样品中双酯型生物碱含量增加,产生的新物质经HPLC-MS分析,初步判定其中一种新成分为毒性小、药效较高的单酯型生物碱—苯甲酰乌头碱。④减毒增效实验结果表明,较之生附子,生物转化后的附子毒性降低,药理活性增强,说明采用黑曲霉对附子进行生物转化能够达到减毒增效的目的。结论HPLC含量测定方法稳定可靠,可作为附子中3种双酯型生物碱含量测定方法;附子指纹图谱方法可行,可作为附子产品质量控制方法;采用黑曲霉对附子进行生物转化,能够达到减毒增效的目的,为附子炮制新方法的深入研究提供了理论依据。