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研究目的镁离子(Magnesium ion,Mg2+)是人体内必需的微量元素,维持着人体各器官的健康和正常生理活动。Mg2+可提高骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的成骨分化能力和细胞活力。BMSCs修复骨组织损伤的能力,不仅通过BMSCs干性分化为受损细胞促进骨组织愈合,而且通过旁分泌产生外泌体调节靶细胞修复受损骨组织。然而在体外培养过程,BMSCs随着传代次数增加出现衰老状况,而BMSCs衰老过程伴随其成骨分化能力减弱,成脂分化能力明显增强,促进骨再生的能力也相应减弱。近年来研究表明BMSCs来源的外泌体（Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs-Exo）能够促进BMSCs成骨作用和改善衰老状况。近年来大量研究表明Mg2+具有促进BMSCs向成骨分化的能力,而Mg2+能否延缓BMSCs衰老状态?外泌体是否促进衰老BMSCs成骨分化?这些问题目前尚不明确。因此,为阐释这些问题,我们以BMSCs为研究对象,探讨外泌体介导Mg2+调控BMSCs衰老状况和促进成骨分化情况。研究方法1、原代培养大鼠BMSCs,并对其多系分化的干细胞潜能进行鉴定。2、制备Mg2+浓度为5 m M、10 m M、15 m M和20 m M的细胞培养基,与BMSCs共培养,通过CCK-8检测不同浓度Mg2+对BMSCs活力的影响,通过PCR检测成骨分化相关基因Col1a1的表达情况。3、Mg2+与BMSCs共培养实验分组为:（1）年轻细胞组（Y组）:第3代至第5代（Passage,P3-P5）;（2）衰老细胞组（S组）:P10-P15;（3）衰老细胞添加Mg2+组（S+M组）:取P10-P15添加10 m M Mg2+;（4）年轻细胞持续添加Mg2+的衰老细胞组（M组）:P3添加10 m M Mg2+传代至P10-P15。进行下列检测:（1）衰老相关-β-半乳糖苷酶（Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal）染色法检测BMSCs衰老程度。（2）通过免疫荧光和Western blot检测BMSCs衰老相关蛋白标志物P53、P21、P16。4、收集BMSCs培养基上清:（1）Y组:收集P3-P5培养基上清;（2）S组:收集P10-P15培养基上清;（3）S+M组:收集S+M组P10-P15培养基上清;（4）M组:收集M组P10-P15培养基上清。各组细胞培养基上清液通过梯度超速离心法获取各组BMSCs-Exo。放置于-80℃低温冰箱内保存。5、外泌体鉴定:通过透射电镜观察各组BMSCs-Exo的形态结构,纳米粒子分析系统检测外泌体样品中颗粒的粒径,Western blot实验检测BMSCs-Exo的表面抗原。6、蛋白组学分析各组BMSCs-Exo,寻找出关键的成骨相关蛋白。Western blot检测各组BMSCs-Exo中成骨相关蛋白（GDF-11、BMP-2和OPN）的表达水平和PCR检测衰老BMSCs与各组BMSCs-Exo共培养后BMSCs中成骨基因（Alp和Bmp-2）的表达情况。研究结果1、分离培养BMSCs呈漩涡状生长,形态为长梭形,能分化为成骨细胞和脂肪细胞,符合BMSCs的特征。2、Mg2+在5 m M-10 m M的浓度范围,BMSCs的细胞活力和成骨分化相关基因Col1a1的表达水平较对照组明显增加,而更高浓度Mg2+组（15 m M-20 m M）BMSCs的细胞活力较对照组明显降低。3、Mg2+延缓BMSCs衰老:随着复制代数增加,衰老BMSCs的SA-β-Gal染色阳性率增加,细胞衰老标志物P53、P21和P16蛋白表达水平明显升高。然而在S+M组中,SA-β-Gal染色阳性率比S组中明显降低,细胞衰老标志物P53、P21和P16蛋白表达水平显著下降。4、BMSCs-Exo呈双面凹的圆形或椭圆形,直径约30～150 nm,Western blot检测证实其表达外泌体标志蛋白ALIX（Apoptosis-linked gene 2-interacting protein X,ALIX）和TSG101（Tumor susceptibility gene101,TSG101）,鉴定为外泌体。5、Mg2+能显著提高BMSCs-Exo中OPN和BMP-2蛋白的表达水平,外泌体介导镁离子提高衰老BMSCs中Alp和Bmp-2的基因表达水平。研究结论1、大鼠BMSCs随着细胞代数的增加出现衰老,衰老标志物（P53、P21和P16）的表达增加。2、添加适宜浓度的Mg2+后,细胞中衰老标志物和β-半乳糖苷酶表达量下降,说明Mg2+延缓大鼠BMSCs的衰老状况。3、外泌体在Mg2+促进衰老BMSCs成骨分化过程中起重要作用,即Mg2+促进成骨分化作用可能是通过外泌体的信息传递进一步促进成骨分化。