【摘 要】
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研究背景:食管癌在我国是最常见的消化道肿瘤之一,主要组织类型为食管鳞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）,其具有高度侵袭性,易发生转移复发。胰岛素样生长因子结合蛋白1（Insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP1）属于胰岛素样生长因子家族（Insulin-like growth factor,
【基金项目】
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国家自然科学基金（81972801）； 广东省基础与应用基础研究基金（2019A1515011873）； 李嘉诚基金会交叉研究项目（2020LKSFG01B）；
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研究背景:食管癌在我国是最常见的消化道肿瘤之一,主要组织类型为食管鳞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）,其具有高度侵袭性,易发生转移复发。胰岛素样生长因子结合蛋白1（Insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP1）属于胰岛素样生长因子家族（Insulin-like growth factor,IGF）的一员,据相关文献报道,IGFBP1可通过IGF依赖或非依赖性机制促进或抑制肿瘤增殖、迁移、侵袭和粘附等恶性行为。在前期研究工作中,我们发现IGFBP1在ESCC患者血清中显著升高,且对早期ESCC具有很好的诊断效能,是一种十分有前景的ESCC早期诊断分子标志物。然而,IGFBP1在ESCC中发挥怎样的功能,分子作用机制是什么,等等,这些科学问题尚未见任何研究报道,值得深入探讨。本论文通过分析IGFBP1在ESCC组织细胞中的表达情况,进而开展生物学功能与分子作用机制探索,为IGFBP1作为ESCC早期诊断分子标志物提供基础理论依据。实验方法:1.通过分析GEO数据库中的GSE45670和GSE53624数据集及TCGA数据库ESCC相关数据,初步探究IGFBP1 m RNA在ESCC组织中的表达情况和预后价值。接着,通过免疫组化实验,分析IGFBP1在200对ESCC组织和配对癌旁正常组织中的表达水平,及其与临床病理参数和预后之间的相关性。2.通过质粒过表达和慢病毒sh RNA转染分别构建IGFBP1稳定过表达和敲降食管癌细胞株,结合迁移、侵袭等细胞功能实验和蛋白免疫印迹、免疫荧光等技术方法,探讨IGFBP1对食管癌细胞迁移侵袭能力的影响。3.利用IGFBP1稳定过表达和敲降细胞株,运用RNA-seq分析寻找差异表达基因,再者,利用蛋白免疫印迹实验、外源性IGFBP1重组蛋白处理和通路抑制剂处理等手段,综合评估IGFBP1对食管癌细胞相关分子信号通路的影响,探究IGFBP1调节食管癌细胞迁移侵袭行为的分子作用机制。实验结果:1.在GSE45670和GSE53625两个GEO数据集中,相对于癌旁正常组织,IGFBP1在食管鳞癌组织中显著高表达;TCGA数据库分析结果显示,IGFBP1高表达预示了患者更差的总生存时间与疾病特异生存时间,且与ESCC分化程度和N分期相关（p＜0.05）。2.免疫组化结果显示,在ESCC组织细胞中,IGFBP1在胞浆与胞核中均有表达,但主要表达于细胞浆中。相对于癌旁正常组织,IGFBP1在ESCC组织表达显著升高（p＜0.05）。Kaplan-Meier分析提示,IGFBP1高表达与食管癌患者更差的总生存时间与无疾病生存时间存在显著相关性,且可作为判定食管鳞癌患者预后的独立危险因子。3.免疫印迹实验检测发现IGFBP1在KYSE140细胞中表达相对较高,在KYSE30细胞中表达相对较低。以KYSE30作为IGFBP1过表达细胞模型,KYSE140细胞作为IGFBP1敲降细胞模型,免疫荧光结果发现,IGFBP1主要定位于食管癌细胞KYSE30与KYSE140胞浆中。过表达IGFBP1能够促进食管癌细胞的迁移侵袭能力,反之,敲降IGFBP1表达可抑制食管癌细胞的迁移侵袭能力。4.利用RNA-seq实验,经GO富集发现,IGFBP1的差异表达主要影响细胞运动功能方面相关基因,诸如上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）进程、细胞外基质重构和细胞黏附等方面。免疫印迹实验结果显示,IGFBP1过表达可增强ERK1/2表达和细胞EMT进程;添加外源性IGFBP1重组蛋白同样可增强ERK1/2表达和细胞EMT进程,并且呈现剂量依赖效应。相反,IGFBP1敲降表达降低ERK1/2表达和细胞EMT进程。利用ERK1/2抑制剂U0126对空载对照细胞和IGFBP1过表达细胞进行处理,结果发现,细胞EMT进程和迁移愈合能力都受到了抑制,但相比于空载对照细胞加药组,IGFBP1过表达细胞加药组的迁移和愈合能力相对增强。另外,免疫印迹结果提示U0126也可抑制IGFBP1的表达。结论:IGFBP1在食管癌组织中高表达并且与患者生存时间呈相关性,提示IGFBP1是食管癌潜在的预后分子标志物。在分子机制上,IGFBP1可通过影响ERK1/2信号通路诱导食管癌细胞的EMT进程,进而影响食管癌细胞的迁移侵袭能力。
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