为了探讨豆粕、大豆对肝细胞是否具有损伤作用及其作用机制,以大豆水提物(Soybean aqueous extract,SAE)、豆粕水提物(Soybean meal aqueous extract,SMAE)为实验材料,以草鱼离体培养的原代肝细胞为试验对象,将SMAE、SAE分别以终浓度为0、0.5、5.0、10.0 mg/mL加入到细胞培养液中培养24h后进行取样分析,研究其对肝细胞的氧化损伤、调控和代谢机制。本文的主要内容如下:第一部分:SAE、SMAE对草鱼原代肝细胞氧化损伤的影响采用CCK-8法检测细胞活力,透射电子显微镜观察肝细胞的超微结构,对细胞核进行Hoechst 33285荧光染色观察,检测细胞抗氧化相关酶活力,此外,检测细胞凋亡率、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)的变化及细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量。结果表明,随着水提物浓度的升高,肝细胞相对活力下降,细胞活力与浓度呈正相关关系。低浓度(0.5 mg/mL、2.5 mg/mL)下的SAE、SMAE组细胞活力与对照组相比无显著性差异。SAE组(5.0 mg/mL、10.0 mg/mL)剂量下相对细胞相对活力分别为78.10±8.57%、65.97±7.35%,与对照组相比具有极显著差异(P<0.01),同浓度下的SMAE组细胞相对活力分别为86.35±7.17%、80.26±7.08%,与对照组相比有极显著差异(P<0.01)。肝细胞超微结构可见染色质沿核膜的环状凝结、稀疏的光密度、线粒体肿胀和数量的减少、脂滴堆积等。Hoechst 33285染色观察到10.0 mg/mL浓度下的SAE和SMAE组荧光强度明显减弱,染色不均匀(染色质凝集),核破碎,少数凋亡小体出现。在低剂量组(0.5 mg/mL、2.5 mg/mL)细胞上清液中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量与对照组相比无差异,高剂量组(5.0 mg/mL、10.0mg/mL)中,培养液中的LDH含量与对照组相比,差异极显著(P<0.01)。培养液中的丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量趋势呈现上升状态(P<0.01),SAE和SMAE高剂量(5.0 mg/mL、10.0 mg/mL)组细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。通过流式细胞术检测细胞MMP和ROS水平,SAE和SMAE能够显著降低MMP,增加细胞内ROS含量(P<0.05)。经SAE、SMAE处理后,凋亡细胞比例明显升高(P<0.05)。凋亡细胞数量呈剂量依赖性增加。0.5 mg/mL和2.5 mg/mL剂量组与对照组的凋亡比相比没有显著性差异,5.0 mg/mL 和 10.0 mg/mL 浓度 SAE 组凋亡比为 22.55±4.35%、55.03±2.76%,SMAE组的凋亡比分别为32.67±5.79%、37.11±8.57%,均与对照组相比有极显著差异(P<0.01)。以上结果表明,SAE和SMAE对肝细胞的损伤程度与添加量呈正相关,且SAE与SMAE表现出相同的损伤作用,当添加量超过5.0 mg/mL时,与对照组相比有显著性差异。SAE和SMAE会导致细胞超微结构改变,细胞内ROS水平升高,细胞抗氧化系统的紊乱和线粒体结构和功能的异常,最终影响细胞活力,触发细胞死亡途径。第二部分:SAE、SMAE引起草鱼原代肝细胞损伤的转录组分析为了阐明水提物在整体水平上是如何影响肝细胞正常生命活动,通过采用RNA-seq的转录组学在整体水平上分别分析正常组、SAE(5.0 mg/mL)组和SMAE(5.0 mg/mL)组肝细胞转录本,根据统计学差异标准,默认参数:p-adjust<0.05和|log2FC|>=1,筛选差异表达基因,将差异表达基因进行GO功能注释、GO富集分析,KEGG pathway信号通路富集分析(Corrected P-Value<0.05)对其进行系统研究。本研究中SAE组肝细胞获得了 869个差异表达基因,上调337个,下调532个。结果显示,SAE组差异富集最显著的基因群主要涉及“蛋白质水解的调控”、“水解酶活性的负调控”、“细胞脂质代谢过程”、“类异戊二烯代谢过程”等生物学过程;“酶活性抑制剂”、“肽酶抑制剂活性”、“肽链内切酶抑制剂活性”、“氧化还原酶活性”等分子功能,位于“细胞外空隙”及“细胞外区域部分”等细胞组分。显著富集的KEGG调控通路也多集中在“类固醇生物合成”、“补体和凝血级联”、“PPAR信号通路”、“细胞因子-受体相互作用”以及营养物质的代谢合成通路等。SMAE组获得了 1451个差异表达基因,上调440个基因,下调101 1个基因。将注释基因进一步差异表达分析,SMAE组差异富集最显著的基因群主要涉及“氧化还原过程”、“催化活性的负调节”、“小分子代谢过程”以及蛋白质水解代谢相关调控等生物学过程;“氧化还原酶活性”、“肽酶调节”、“肽酶抑制剂活性”等相关分子功能,位于“细胞外空隙”及“细胞外区域部分”等细胞组分。显著富集的KEGG调控通路也多为集中在“补体和凝血级联”、“细胞因子-受体相互作用”、“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”、“甘油三酯代谢”以及“NFκB信号通路”等。上述结果表明,富集到的通路多与炎症反应,蛋白质、氨基酸和脂类代谢有关,说明肝细胞的营养代谢发生紊乱,细胞膜受体介导信号转导功能受到调控,引起机体能量代谢发生变化。且SAE组肝细胞富集到“类固醇生物合成”、“PPAR信号通路”、“花生四烯酸代谢”、脂肪酸代谢等多个脂肪酸代谢途径,通过“类固醇生物合成通路”调控肝细胞脂肪沉积。第三部分:代谢组学对SAE、SMAE调控草鱼原代肝细胞代谢的研究采用UPLC/MS技术获取对照组和5.0 mg/mL浓度下SAE组、SMAE肝细胞的代谢物轮廓信息,包括胞内代谢物和胞外代谢物,利用多元统计分析方法如主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析法(OPLS-DA),通过变量重要性投影(VIP>1)选取潜在的生物标志物,结合质谱碎片信息和数据库检索对潜在生物标志物进行结构鉴定。结果显示结果表明大多数样品都落在95%置信区间的椭圆形内,无离群点,且SAE组和SMAE组肝细胞代谢物表型的聚类分布均偏离对照组。细胞内液中对照组分别与SAE、SMAE共筛选出的1 1个内源性小分子代谢物被视为水提物对肝细胞内源性代谢产生扰动的潜在生物标记物,分别是UDP-D-半乳糖(UDP-D-galactose)、1-羟基-3-壬酮(1-Hydroxy-3-nonanone)、7-羟基甲氨蝶呤(7-hydroxymethotrexate)、磺基转移酶家族成员({[(3E)-4-(5-hydroxy-1-oxo-1H-isochromen-3-y1)but-3-en-1-y1]oxy}sulfonic acid)和精氨酰-脯氨酸(Arginyl-Proline)表现为上调趋势,谷胱甘肽(Glutathione)、L-精氨酸(L-Arginine)、吲味(Indole)、磷脂酰丝氨酸(PS(14:0/16:1(9Z)))、直链淀粉(Amylose)和吲哚乙醛(Indoleacetaldehyde)表现为下调趋势。将鉴定到的差异代谢物输入MetaboAnalyst的MetPA平台构建关联代谢通路,主要集中在谷胱甘肽代谢、精氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢通路。在细胞外液代谢组中筛选出 30个显著差异代谢物,分别是N-酰基-L-苯基丙氨酸(N-Acetyl-L-phenylalanine)、N-酰基-D-苯基丙氨酸(N-Acetyl-D-phenylalanine)、N-乙酰鸟氨酸(N-Acetylornithine)、胆碱(Choline)、L-组氨酸(L-Histidine)、5,6-对甲苯胺(5,6-DHET)、香草醛(Vanillin)、直链淀粉、鸟苷(Guanosine)、鸟嘌呤(Guanine)、吡啶衍生物(5-(3-Pyridyl)-2-hydroxytetrahydrofuran)等,集中在组氨酸代谢和嘌呤代谢两条通路上。上述结果表明,内源性产物在整个代谢轨迹中产生了强烈的扰动而且与造成肝细胞损伤密切相关,组氨酸代谢和嘌呤代谢通路对细胞TCA循环、核苷酸代谢、氨基酸代谢紊乱进而引起肝脏的炎症,导致肝内脂类聚集并影响细胞膜完整性。