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糖尿病心肌病是糖尿病主要并发症之一,心肌纤维化是DCM的重要病理特征之一,同时糖尿病心肌纤维化是引起心力衰竭的发病率和死亡率的主要因素之一。目前,对DCM的治疗主要依赖生物化学类降糖剂如胰岛素、甲苯磺丁脲等,这些药物通常伴随着相当大的副作用,如低血糖、耐药性、水肿和体重增加,效果不尽如人意。缺乏针对DCM有效的治疗方法。DCM病理机制较多,如微血管改变、氧化应激、炎症因子和纤维化,其中氧化应激是关键因素。尚无确切药物用于治疗DCM,可能与单味药物作用靶点单一有关,而传统中药具有作用靶点多的优势,因此需要开发新的、更好的、安全的传统中药来控制和治疗DCM。丹皮酚又名牡丹酚,是毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa的根皮和萝摩科植物徐长卿Pycanostelma paniculatum（Bunge）K.Schum干燥根或全草的主要有效成分,具有抗炎抗氧化,抗肿瘤,同时具有降血糖,降低2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用。三七总皂苷panax notoginseng saponins,是五加科人参属三七的主要有效成分,多用来防治心脑血管疾病,其药理作用广泛包括抗癌,神经保护、降血糖并预防糖尿病并发症。本课题组前期研究发现Pae和PNS组方可抑制心脏成纤维细胞Ⅰ型,Ⅲ型胶原蛋白的基因表达,亦可逆转大鼠心梗后心室重构引起的心肌纤维化。但两者联用是否有抗DCM心肌纤维化的作用,相关研究尚未见报道。本研究依照现代医学对疾病的发生发展规律的认知,运用糖尿病心肌病动物模型在整体水平上探讨二者联合应用在改善DCM心肌纤维化方面是否有协同作用及其机制。第一部分丹皮酚联合三七总皂苷对糖尿病心肌病心肌纤维化的保护作用目的:观察丹皮酚联合三七总皂苷对大鼠糖尿病心肌病心肌纤维化的影响。方法:1 DCM模型:SPF级雄性SD大鼠体重（200±10）g,标准饲料适应喂养1周后,通过高脂高糖饲料喂养6周联合腹腔注射小剂量STZ制糖尿病心肌病模型,以注射STZ后第3,7天,尾部静脉采血测大鼠空腹血糖,血糖≥16.7 mmol·L-1视为2型糖尿病模型成功,喂养8周后,每组各取1只大鼠行病理组织学检测,出现心肌纤维化、心肌胶原形成的改变说明模型成功。2联合用药剂量筛选:按照二因素五水平均匀设计方法,以心肌组织Masson染色测定的心肌胶原容积分数为观测指标,采用多元回归分析确定丹皮酚80 mg·kg-1联合三七总皂苷100 mg·kg-1对糖尿病心肌病大鼠为最佳组合剂量。3运用2×2析因设计试验分析两者之间有无交互作用,设空白组,模型组,丹皮酚(80 mg·kg-1)组,三七总皂苷(100 mg·kg-1)组,丹皮酚(80mg·kg-1)+三七总皂苷(100 mg·kg-1)组,二甲双胍(157.5 mg·kg-1)组。第9周开始给药干预,丹皮酚,三七总皂苷和二甲双胍分别溶于羧甲基纤维素钠（1%）灌胃,空白组和模型组灌等体积羧甲基纤维素钠,1次/d,给药6周。干预6周后测空腹血糖和体重后取材;测定每组大鼠心重指数;酶联免疫吸附试验测INS,GHb,LDH,AST,CK-MB的含量,HE和Masson染色观察各组大鼠心肌组织病理学变化和心肌纤维化程度。结果:1药物剂量筛选结果将表1数据进行多元方程回归,得方程Y=21.883-0.050X1-0.060X2,X1是Pae,X2是PNS,Y是心肌胶原容积分数（CVF）。方程经方差分析P<0.05,表明方程可信。由方程可知,随两药剂量增大,CVF减小,故于此实验前提条件下,理论上当Pae与PNS以80,100 mg·kg-1组合,CVF最小,此时,Y（CVF）的95%的可信区间为[8.52,13.43],本实验测得的实际数值为10.98,2×2析因设计试验结果为9.09,都在此区间内,说明得出的最佳的试验条件是可信的。2 2×2析因设计试验结果2.1对血糖和体重及心重指数的影响与NC组比较,DCM组大鼠体重明显降低（P<0.05）,FBG,HWI均明显升高（P<0.05）;与DCM组比较,各用药组大鼠体重明显增加,FBG,HWI也均有降低（P<0.05）,其中,Pae+PNS组相对于Pae组和PNS组对体重,FBG,HWI的影响均有差异（P<0.05）。2.2对INS,GHb,LDH,AST,CK-MB水平的结果与NC组比较,DCM组血清中INS明显升高（P<0.05）,而GHb也显著升高（P<0.05）,说明大鼠产生胰岛素抵抗作用,与DCM组相比,各治疗组INS与GHb明显下降（P<0.05）,其中Pae+PNS组与Pae组、PNS组有差异（P<0.05）。与NC组比较,DCM组血清中的LDH,AST,CK-MB水平明显升高（P<0.05）,表明大鼠心肌功能发生改变。与DCM组比较,Pae组、PNS组、Pae+PNS组的LDH,AST,CK-MB水平明显降低（P<0.05）。其中,Pae+PNS组与Pae组、PNS组比较有显著差异（P<0.05）。2.3 HE染色结果光学显微镜观察大鼠心肌组织,NC组形态正常;与NC组比较,DCM组胶原纤维增生成网状,排列紊乱,有纤维瘢痕形成,细胞间隙增宽,心肌细胞肥大,着色不均匀,胞核固缩、破碎、甚至消失。与DCM组相比,各给药组心肌的病理结构都有改善,肌纤维较完整,排布较整齐,细胞形态改善,染色比较均匀,其中联合用药组与单味用药组相比,改善更明显。2.4 Manson染色结果及胶原容积分数的测定结果光学显微镜下可见胶原纤维呈蓝色,肌肉呈红色,细胞核成蓝褐色。NC组胶原纤维极少,无明显的病理学改变。DCM组胶原纤维增生成网状,排布紊乱,大量纤维瘢痕形成。与DCM组相比,各用药组的病理均有不同程度的改善,巨检时均无大量胶原纤维网,心肌胶原有着不同程度的减少,对CVF的作用有差异（P<0.05）,提示药物有不同程度的改善作用。其中,Pae+PNS组与模型组、Pae组、PNS组比较有差异（P<0.05）,且见有交互作用（P<0.05）,表明Pae联合PNS对大鼠糖尿病心肌纤维化具有协同作用。结论:丹皮酚联合三七总皂苷可降低FBG,INS,GHb,改善糖尿病心肌病心肌纤维化,具有协同防治糖尿病心肌病的作用。第二部分丹皮酚联合三七总皂苷对糖尿病心肌病大鼠的Nrf2/ARE信号通路的影响目的:丹皮酚联合三七总皂苷对糖尿病心肌病大鼠的影响是否通过激活Nrf2/ARE信号通路实现的。方法:造模与分组同第一部分方法中的1和3。取材后,采用WST-1法和TBA法分别测定心肌组织中的MDA,SOD活性变化,Real Time PCR法检测各组大鼠心肌组织中Nrf2、HO-1、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的表达水平;Western blot法检测Nrf2、HO-1、SOD、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白蛋白表达水平。结果:1对MDA含量和SOD活力的影响与NC组比较,DCM组心肌组织中MDA水平明显升高（P<0.05）,SOD活力明显降低（P<0.05）;与DCM组比较,Pae组,PNS组,Pae+PNS组,二甲双胍组中的MDA水平明显降低（P<0.05）,SOD活力明显升高（P<0.05）。其中,Pae+PNS组与Pae组,PNS组比较有显著差异（P<0.05）。2 Real Time PCR结果与NC组对比,DCM组大鼠心肌组织中Nrf2、HO-1的mRNA表达水平显著降低（P<0.05）,Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）;与DCM组对比,各用药组心肌组织中Nrf2、HO-1的mRNA表达水平均有不同程度的升高（P<0.05）,Col-Ⅰ、Col-ⅢmRNA的表达量均有不同程度的减低（P<0.05）,且联合用药组较丹皮酚和三七总皂苷单味给药组Nrf2、HO-1升高更显著（P<0.05）,Col-Ⅰ、Col-Ⅲ减低显著（P<0.05）。3 Western blotting检测结果与NC组对比,DCM组大鼠心肌组织中Nrf2、HO-1的蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;与DCM组对比,各用药组心肌组织中Nrf2、HO-1的蛋白表达水平均有不同程度的升高（P<0.05）,Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白的表达量均有不同程度的减低（P<0.05）,且联合用药组较丹皮酚和三七总皂苷单味给药组Nrf2、HO-1升高更显著（P<0.05）,Col-Ⅰ、Col-Ⅲ减低显著（P<0.05）。结论:1丹皮酚联合三七总皂苷可以上调心肌组织中HO-1、SOD的表达,降低MDA的含量,使ROS水平下降,进而抑制Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达,从而改善DCM心肌纤维化。2丹皮酚联合三七总皂苷抗DCM心肌纤维化可能是通过激Nrf2/ARE信号通路而实现。3丹皮酚联合三七总皂苷改善大鼠DCM心肌纤维化方面明显优于单味用药,提示联合用药有协同作用。