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研究目的下咽癌是头颈部常见恶性肿瘤之一,尚缺乏有效的治疗手段。STK33是一个非常有潜力的进行有效分子治疗的基因,但是其在恶性肿瘤中的相关生物功能和分子机制尚不清楚。本课题拟借助RNM技术明确STK33对下咽癌细胞株Fadu细胞生物学行为增殖与凋亡、细胞周期、肿瘤细胞克隆集落能力、侵袭和转移、以及上皮细胞间叶转化的影响,并通过分子生物学技术了解其中可能存在的分子机制以及ERK1/2信号通路在其中可能存在的调节作用。研究方法：1.Fadu细胞中STK33的表达及STK33-RNAi慢病毒的构建与转染1)通过IHC方法检测30例人下咽癌组织与配对的正常粘膜组织中STK33的蛋白质表达情况。2)构建STK33-RNAi和对照慢病毒载体,并进行RNAi慢病毒包装和滴度检测。3)将STK33-RNAi和对照慢病毒转染入Fadu细胞中,并进行转染效率测定。4)Western blot方法检测转染慢病毒后Fadu细胞中STK33蛋白表达的变化。2.STK33-RNAi和PD98059对Fadu细胞增殖与凋亡的影响1)Fadu细胞复苏、传代培养,按照Mock、5 μM PD98059、STK33-RNAi、STK33-RNAi & 5μM PD98059进行分组。2)MTT实验首先确定PD98059对Fadu细胞作用的最佳浓度和时间,在此基础上了解STK33-RNAi和PD98059对Fadu细胞活性的影响。3)Hoechst.33342&PI双染实验了解STK33-RNAi和5μM PD98059对Fadu细胞凋亡的影响。4)流式细胞术细胞周期实验了解STK33-RNAi和5μM PD98059对Fadu细胞细胞周期的影响。5)肿瘤细胞克隆集落形成实验了解STK33-RNAi和5μM PD98059对Fadu细胞克隆集落形成能力的影响。6)通过Real-time PCR和Western blot实验了解STK33和ERK1/2之间可能存在的关系。7)通过Real-time PCR了解STK33-RNAi和5μM PD98059对Fadu细胞增殖与凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、Ki-67在mRNA水平的影响。8)通过Western blot实验从蛋白水平了解STK33-RNAi和5μM PD98059对Fadu细胞增殖与凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、Ki-67的影响。3. STK33-RNAi和5 μM PD98059对Fadu细胞侵袭、转移以及上皮问叶转化的影响1)IHC方法检测STK33在人下咽癌组织不同分化程度、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移与否中的表达情况2) Fadu细胞复苏、传代培养,按照Mock、5 μM PD98059、STK33-RNAi、STK33-RNAi & 5μM PD98059进行分组。3)肿瘤细胞侵袭与转移实验了解STK33-RNAi和5 μM PD98059对Fadu细胞侵袭和转移行为的影响。4)通过Real-time PCR了解STK33-RNAi和5μM PD98059 对 Fadu细胞上皮细胞间叶转化和转移相关基因E-cadherin、Vimentin、Nm-23在mRNA水平的影响。5)通过Western blot实验从蛋白水平了解STK33-RNAi和5μM PD98059对Fadu细胞上皮细胞间叶转化和转移相关基因E-cadherin、Vimentin、 Nm-23的影响。4.统计学处理应用SPASS 18.0统计学软件进行数据的统计分析处理。计量资料用Mean±SD或Mean±SE表示,应用one-way ANOVA分析进行数据的组间比较,以P<0.05认为差异有统计学意义。结果：1.STK33在人下咽癌组织中的表达及STK33-RNAi慢病毒的构建与转染入Fadu细胞1)IHC结果表明配对的人原位下咽癌组织(11.63±3.56)、浸润性下咽癌组织(13.974±3.47)与正常粘膜鳞状上皮细胞(4.17±3.38)中STK33的蛋白质表达均有显著性差异(P<0.05),而且STK33在原位癌和浸润性癌之间的表达也有明显差异(P<0.05)。2)成功构建STK33-RNAi和对照慢病毒载体,并将其成功转染入Fadu细胞内。3)与对照组相比较,STK33-RNAi能显著性降低STK33在Fadu细胞内的蛋白表达水平。2. STK33-RNAi和PD98059对Fadu细胞增殖与凋亡的影响1)通过MTT实验确定5μM PD98059作用Fadu细胞48 h是PD98059对Fadu细胞作用的最佳浓度和时间的基础上,进一步的实验表明与对照组相比较,STK33-RNAi和5μM PD98059不仅能分别显著性降低Fadu细胞活性,而且二者在此作用上具有协同效应。2) Hoechst.33342&PI双染实验检测表明与对照组相比较,STK33-RNAi和5 μM PD9809均分别导致Fadu细胞凋亡,并能协同导致Fadu细胞凋亡。3)流式细胞术检测细胞周期结果显示与对照组相比较,STK33-RNAi对Fadu细胞的G2/M期具有阻滞作用,5μM PD98059阻滞Fadu细胞的G0/G1期。4)肿瘤细胞克隆集落形成实验中,与对照组相比较,STK33-RNAi和 5 μMPD98059具有分别以及协同降低Fadu细胞克隆集落形成的能力。5) Real-time PCR和 Western blot实验一致性表明,在Fadu细胞中,与对照组相比较,5 μM PD98059能明显降低STK33的表达,而ERK1/2的表达在对照组和STK33-RNAi组中没有显著性差异。6) Real-time PCR 和 Western blot实验一致性显示,在Fadu细胞中,与对照组比较,STK33-RNAi和5μM PD98059均能够单独以及协同性显著地降低Bcl-2表达的同时明显增加Ki-67的表达；另外,STK33-RNAi能够明显增加Caspase-3的表达,而5μM PD98059对Caspase-3的作用与对照组比较则没有统计学差异。3. STK33-RNAi和PD98059对Fadu细胞侵袭、转移以及上皮问叶转化的影响1)免疫组化结果显示STK33表达在非角化型鳞癌中显著性高于角化型鳞癌,在肿瘤>2 cm中明显高于肿瘤<2 cm；而且,STK33的IHC得分随着临床分期的增高、淋巴结转移都明显增加。2)肿瘤细胞侵袭与转移实验结果表明,与对照组比较,STK33-RNAi和5μM PD98059均能够单独以及协同性显著地降低Fadu细胞的侵袭和转移能力。3) Real-time PCR实验结果显示,在Fadu细胞中,与对照组相比较,STK33-RNAi和5 μM PD98059具有分别以及协同性显著地增加Nm-23和E-cadherin的mRNA表达水平；另外,STK33-RNAi和5μMPD98059能分别明显降低Vimentin的mRNA表达水平。4) Western blot检测表明,在Fadu细胞中,与对照组相比较,STK33-RNAi 和5μM PD98059具有分别以及协同性显著地增加Nm-23和 E-cadherin的蛋白质表达水平；另外,STK33-RNAi 和 5μM PD98059能分别明显降低Vimentin的蛋白质表达水平。结论和意义：1.我们的研究首次证明STK33在人下咽癌组织中明确表达,并且可能在下咽癌的发生、发展过程中具有重要促进作用。2. STK33-RNAi能显著性降低Fadu细胞的活性,可能通过增加Caspase-3的表达和降低Bcl-2的表达导致细胞凋亡：另外,可能通过下调Ki-67的表达与Fadu细胞阻滞于G2/M期有关,同时与下调Fadu细胞克隆集落形成能力有关。STK33可能是ERK1/2信号通路的下游因子,STK33促进Fadu细胞增殖和克隆集落形成能力、影响细胞周期以及抑制细胞凋亡可能是通过ERK1/2信号通路的作用影响下咽癌的演进,此结果为STK33做为下咽癌分子靶向治疗的潜在因子提供了基础理论依据。3.STK33高表达与人下咽癌组织的分化差、转移、临床分期增高相关。STK33可能通过参与ERK1/2信号通路而协同性抑制E-cadherin的作用,另外通过诱导、Vimentin的作用促进EMT的发生,同时可能通过ERK1/2信号通路下调肿瘤转移抑制基因Nm-23的作用,进而增加Fadu细胞的侵袭和转移能力促使下咽癌的进展更为迅速,此结果为STK33做为下咽癌分子靶向治疗的潜在因子提供了基础理论依据。