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马立克氏病（Marek’s disease,MD）是由马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）引起的一种在家禽中广泛存在的、具有高度传染性的鸡淋巴增生性疾病。MDV主要导致鸡T细胞淋巴瘤,同时伴随着神经系统的水肿和广泛损伤,最终导致鸡瘫痪和死亡,给全球家禽养殖业造成巨大经济损失。尽管MD疫苗的接种取得了暂时性的成功,但随着MDV毒力的不断增加,该病的防治仍然具有较大困难。Meq基因是MDV最主要的致癌基因,能够在潜伏和溶解性感染过程中持续表达,直接诱导肿瘤的发生,且Meq基因的缺失不影响MDV的复制,因此缺失Meq基因以及以Meq基因为靶位插入外源基因的重组MDV疫苗具有良好的发展前景。CRISPR/Cas9基因编辑技术已被成功用于大型DNA病毒基因组的编辑,为MDV功能基因的研究和重组疫苗的构建提供了新思路。通过比较整合有禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）的长末端重复序列（Long terminal repeat,LTR）的MDV活疫苗（rMDV-LTR株）与亲本株（CVI988/Rispens）的免疫效力,发现rMDV-LTR株具有良好的免疫保护效率,是一种安全有效的疫苗,并可作为疫苗载体毒株。通过构建表达MDV Meq蛋白的原核表达质粒p ET28（a）-Meq,将诱导产物免疫BALB/c鼠,得到可用于IFA检测Meq蛋白的多克隆抗体血清,为MDV Meq基因功能的研究提供了检测手段。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以rMDV-LTR株作为研究模型,构建靶向MDV Meq基因的敲除质粒,筛选出px-sg RNA11和px-sg RNA12质粒组合时具有良好的切割效果;连续挑取单蚀斑进行传代培养,最终得到一株MDV Meq基因缺失株;经检测,该MDV基因缺失株已被成功编辑,且与亲本病毒具有相似的蚀斑形态和复制能力。该研究表明利用CRISPR/Cas9技术进行MDV基因编辑方面的有效性和高效性,为加快研究MDV的基因功能提供了一种简单有效的方法。为了快速研发出安全性高、免疫效果好的MDV基因重组疫苗,利用CRISPR/Cas9同源重组修复的方式,对MDV Meq基因切割处插入m Cherry表达盒的Knock-in平台进行了摸索实验。通过构建并不断优化Donor质粒,可将嘌呤霉素抗性和m Cherry报告基因作为提高阳性感染细胞筛选效率的手段;但该细胞中依然含有亲本病毒和重组病毒,说明在Meq基因处构建重组病毒后的筛选纯化仍然存在较大难度,后续仍需继续优化和完善,本研究可为基于CRISPR/Cas9技术快速开发含有禽类病原体保护性抗原基因的多价重组MDV疫苗提供参考。综上所述,整合REV-LTR基因的MDV活疫苗rMDV-LTR株具有良好的免疫效果,可作为后续实验的载体毒株;成功制备了检测MDV Meq蛋白的多克隆抗体且具有良好的特异性,提供了可用的检测手段;利用CRISPR/Cas9基因重组技术成功获得MDV Meq基因缺失株rMDV-LTR-（？）Meq株,为加快研究MDV的基因功能提供了一种简单有效的方法;并对MDV Knock-in平台进行了条件摸索,最终确定荧光基因和嘌呤霉素药物的双重筛选条件在一定程度上提高阳性感染细胞的筛选效率,以期成功构建该Knock-in平台,这对基于CRISPR/Cas9技术快速开发含有其他禽类病原体保护性抗原基因的多价重组MDV疫苗具有重要意义。