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研究背景随着人们生活水平的提高，饮食结构的变化，冠心病(Coronary HeartDisease, CHD)的发病率呈现逐年上升的趋势，特别是心肌梗死近期和远期并发症不仅威胁人类生命，还严重影响人们生活质量。虽然，有研究表明心肌梗死发生后部分心肌细胞有分裂增殖的现象，但仅1%的更新率难以弥补损失的心肌细胞数量，对心功能的改善作用甚微。目前临床治疗冠心病心梗主要集中于挽救非梗死区的心肌细胞，改善心功能。但不管是药物治疗还是介入治疗，或是外科心脏搭桥手术都不能恢复梗死区的心脏功能，所以严重心梗的患者死亡率仍然很高。修复梗死区心肌细胞成为临床医生和医学科学家亟待解决的难题。近年来，很多关于干细胞诱导分化为心肌样细胞修复梗死区心肌细胞以改善心脏功能的研究为冠心病的进一步治疗带来希望。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)用于治疗冠心病心肌梗死的前临床研究已经取得令人鼓舞的进展，但如何解决诱导分化率低的问题是目前需要突破的瓶颈。随着研究的深入，干细胞治疗冠心病将会为患者带来良好的获益。研究目的1.探讨骨髓间充质干细胞（BMMSCs）体外分离培养及纯化方法。2.探索BMP-2诱导骨髓间充质干细胞（BMMSCs）分化为心肌样细胞的实验方法及效果。3.探索BMP-2和5-AZA联合诱导骨髓间充质干细胞（BMMSCs）向心肌样细胞分化的作用。研究方法1.大鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的体外分离及培养：取大鼠四肢长骨骨髓，采用密度梯度离心法结合差速贴壁法分离骨髓内的BMMSCs，传代培养以纯化细胞。取第4代BMMSCs用流式细胞仪进行表面抗原CD29、CD44、CD45检测。倒置相差显微镜动态观察细胞生长情况，并拍照记录。2. BMP-2诱导BMMSCs向心肌样细胞分化：取第4代BMMSCs诱导24h后换液。实验分组为：空白对照组(Control)和BMP-2组(10μg/L)。Western Blot检测2w和4w缝隙连接蛋白43(CX43)及心肌肌钙蛋白I(cTnI)的表达。免疫荧光染色鉴定BMP-2诱导4w后分化为心肌样细胞的cTn I和CX43表达情况。3. BMP-2和5-AZA联合诱导BMMSCs向心肌样细胞分化：取第4代BMMSCs进行诱导分化，实验分组如下：空白对照组(Control)、5-AZA组(10μmol/L)、BMP-2组(10μg/L)、BMP-2+5-AZA组(10μg/L+10μmol/L)。前3组诱导24h后换完全培养液，联合诱导组共诱导48h后换完全培养液。诱导终止后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。培养4w后免疫荧光染色鉴定细胞cTnI、CX43蛋白的表达；Western Blot法检测cTn I、CX43蛋白表达量的变化；流式细胞仪检测各诱导组MSCs分化为心肌样细胞的分化率。研究结果1.大鼠BMMSCs体外培养的形态学特征：原代BMMSCs体积小，胞核较小，形态多样，主要为短梭形，还有椭圆形、星形、不规则形，有大小、长短不等的突起伸出胞体。1w后细胞呈集落样成长，排列规则，可见到漩涡样结构。传代后的细胞体积变大，排列不规则，核浆比变大，形态不均，排列紊乱。流式细胞仪BMMSCs表面抗原鉴定结果为：CD29阳性表达率为(94.4±3.59)%，CD44阳性表达率为(88.4±1.51)%，CD45阳性表达率为(2.6±0.40)%。2. BMP-2诱导BMMSCs向心肌样细胞分化：倒置相差显微镜下Control组细胞无明显变化；BMP-2组细胞体积及核浆比明显增大，细胞呈长梭形，生长方向随着时间延长趋于一致、排列规则、细胞间连接紧密，4w时细胞出现肌岛样结构。免疫荧光染色提示：4w时可见BMP-2组细胞cTn I和CX43表达，Control组未见cTn I表达，仅有少量CX43表达。WesternBlot检测cTn I及CX43蛋白表达水平，2w时BMP-2组cTn I及CX43有少量表达；4w时BMP-2组cTn I及CX43表达增强，明显高于2w时的表达。3. BMP-2和5-AZA联合诱导BMMSCs向心肌样细胞分化：流式细胞仪检测各组诱导终止后活细胞数百分比，结果显示5-AZA组活细胞数占细胞总数(45.23±5.73)%，BMP-2组活细胞数占细胞总数(73.56±3.78)%,BMP-2+5-AZA组活细胞数占细胞总数(68.75±6.82)%。倒置相差显微镜下细胞的形态学变化：除Control组细胞无明显变化外；各组细胞形态均明显变大、呈长梭形，细胞核增大，细胞间联系紧密，细胞排列一致、生长趋于集中，4w时形成肌岛样结构。免疫荧光染色提示：诱导2w时Control组未见cTn I表达，其余3组均可见少量表达；4w时Control组仍未见表达，其余3组cTn I表达均明显较2w时增强，且联合诱导组表达高于5-AZA组和BMP-2组。Western Blot检测cTnI及CX43蛋白表达水平，2w时Control组微弱表达，其余三组有少量表达；4w时Control组仍表达微弱，其余三组cTn I及CX43表达明显增强，分别与Control组比较均有显著统计学差异(P＜0.01)；联合诱导组明显高于5-AZA组和BMP-2组，组间两两比较均有统计学差异（P＜0.05)，4w与2w组内比较均有统计学差异（P＜0.05)。流式细胞仪检测心肌样细胞分化率：结果显示，空白对照组FITC标记的阳性细胞数占细胞总数(2.05±0.39)%；5-AZA组FITC标记的阳性细胞数占细胞总数(23.78±1.53)%； BMP-2组FITC标记的阳性细胞数占细胞总数(17.53±1.06)%；BMP-2+5-AZA组FITC标记的阳性细胞数占细胞总数(27.99±2.01)%。5-AZA组、BMP-2组和BMP-2+5-AZA组与Control组比较均有显著统计学差异(P＜0.01)。研究结论1. BMP-2和5-AZA联合诱导提高BMMSCs分化率达(27.99±2.01)%，且细胞死亡率明显低于5-AZA单独诱导组，是一种安全高效的诱导分化方法。2.BMP-2可以诱导BMMSCs分化为心肌样细胞并表现相应生物学特征，但分化率为(17.53±1.06)%，效果不优于单纯5-AZA诱导。3.采用密度梯度离心与差速贴壁相联合的分离方法可以获得BMMSCs，流式细胞仪检测第4代BMMSCs表面抗原证实可以获得高纯度BMMSCs。