论文部分内容阅读
背景:甲状腺癌是内分泌系统常见的恶性肿瘤,近年来在全球范围内,其发病率呈明显上升的趋势。其中甲状腺乳头状癌发病率最高,约占甲状腺癌总数的80%。尽管该肿瘤生物学行为表现为惰性,患者经过常规的诊断和治疗预后良好,5年生存率可达到90%以上,但长期随访发现仍有部分患者术后出现复发和远处转移,严重影响生活质量,大幅度缩短生存时间。探索甲状腺乳头状癌发生发展的分子机制具有重要的价值。长链非编码RNA（Longnon-coding RNA,lncRNA）是指一类长度超过200个核苷酸的RNA分子,因开放阅读框架的缺失,绝大多数lncRNA难以编码蛋白,最初被认为是转录噪音,不具备生物学功能。近些年,随着高通量转录组测序的发展及普及,越来越多的lncRNA被发现鉴定,相关研究逐步深入,lncRNA因其在基因转录、翻译、剪切及修饰等生物学过程中的重要作用也备受关注。目前在甲状腺乳头状癌中已发现SLC26A4-AS1、FER1L4等lncRNA分子表达失调,调控肿瘤细胞的恶性生物学行为,这些结果补充了甲状腺乳头状癌发生发展的分子机制网络,为今后诊断治疗提供了新的策略。本研究拟从lncRNA分子着手,通过对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中甲状腺癌lncRNA测序数据进行差异表达分析,结合组织qRT-PCR验证,筛选出甲状腺乳头状癌中差异表达显著的lncRNA,采用一系列分子生物学实验探索其对甲状腺乳头状癌细胞功能表型的影响,最后再探讨其潜在的分子作用机制。第一部分:LncRNALINC00284在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义目的:筛选甲状腺乳头状癌组织与癌旁组织中差异表达的lncRNA并评估其临床意义。方法:（1）利用Sangerbox3.0生信工具盒下载TCGA数据库中甲状腺癌lncRNA测序数据,通过“转录组Count数据差异分析”工具进行lncRNA差异表达分析,寻找差异显著的lncRNA,初步确定研究对象;（2）采用qRT-PCR在收集的25例甲状腺乳头状癌样本中检测所选择lncRNA的表达水平,寻找差异最为显著的lncRNA,确定为最终研究对象;（3）利用TCGA中挑选出的58例配对甲状腺癌及癌旁组织（根据TCGA中每个组织的编号进行挑选）的RNA测序数据,以及GEO数据库中5对甲状腺癌组织的RNA测序数据验证所选lncRNA的差异表达情况;（4）扩大甲状腺乳头状癌样本量至75例,采用qRT-PCR再次验证所选lncRNA的差异表达情况;（5）通过qRT-PCR在甲状腺乳头状癌细胞株和正常甲状腺滤泡上皮细胞株检测所选lncRNA的表达水平;（6）分析所选lncRNA表达与江阴市人民医院诊治的甲状腺乳头状癌患者临床病理特征的关系,包括性别、年龄、腺外侵犯、肿瘤大小、淋巴结转移、多灶性和TNM分期。结果:（1）通过TCGA数据库中甲状腺癌lncRNA差异表达分析,筛选出甲状腺癌中功能尚未研究、差异表达位于前十位的lncRNA（NPSR1-AS1、CHIAP2、LINC02738、RPSAP52、IGFL2-AS1、LINC00284、LINC01977、TMEM92-AS1、LAMP5-AS1和LINC01705）;（2）在收集的25例甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织中,利用qRT-PCR检测10个lncRNA的表达,发现LINC00284在甲状腺乳头状癌组织较癌旁组织表达升高最显著（差异倍数为3.8,P＜0.0001）,确定其为研究对象;（3）TCGA数据库中58例配对的甲状腺癌组织和癌旁组织的RNA测序数据进一步证实LINC00284在甲状腺癌中表达升高,相同的结果在GEO数据库中5例配对的甲状腺癌组织和癌旁组织中得到印证;（4）利用qRT-PCR在75例甲状腺乳头状癌和癌旁组织中检测LINC00284表达,发现其在癌组织中表达显著升高;（5）qRT-PCR结果显示,在甲状腺乳头状癌细胞株（IHH-4、TPC-1和K-1）中LINC00284表达均高于正常甲状腺滤泡上皮细胞株（Nthy-ori3-1）;（6）LINC00284的表达与患者肿瘤大小相关,即LINC00284高表达的患者肿块体积更大（P=0.014）,未发现LINC00284的表达和甲状腺乳头状癌腺外侵犯、淋巴结转移、多灶性及TNM分期存在相关性。结论:LncRNALINC00284在甲状腺乳头状癌组织及细胞株中表达显著升高,且LINC00284高表达的患者病灶体积更大,提示其与甲状腺乳头状癌的恶性生物学特性有关。第二部分:LncRNALINC00284对甲状腺乳头状癌细胞增殖能力的影响目的:研究lncRNALINC00284表达对甲状腺乳头状癌细胞体内外增殖能力及周期凋亡进程的影响。方法:（1）设计特异性干扰LINC00284表达的siRNA序列,通过瞬时转染法将siRNA转染至甲状腺乳头状癌细胞中敲低LINC00284的表达,并通过qRT-PCR验证;（2）敲低LINC00284表达后,通过CCK-8、集落形成和EdU实验检测甲状腺乳头状癌细胞增殖能力的变化;（3）下调LINC00284表达后,采用流式细胞仪检测细胞周期凋亡的变化,并通过western blot检测周期凋亡相关蛋白的表达水平;（4）敲低LINC00284表达行裸鼠皮下成瘤实验,探索其体内功能,并通过免疫组化检测裸鼠移植瘤中增殖相关蛋白Ki-67的表达。结果:（1）qRT-PCR检测显示,siRNA可以显著敲低甲状腺乳头状癌细胞TPC-1和K-1中LINC00284的表达;（2）CCK-8、集落形成及EdU实验发现,敲低LINC00284表达可以显著减弱甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力;（3）流式细胞检测结果显示,下调LINC00284表达可导致甲状腺乳头状癌细胞周期阻滞在G1期,并且可以诱导细胞凋亡,western blot检测发现下调LINC00284表达,可显著降低G1-S期标志蛋白CDK4、Cyclin D3和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bak的表达;（4）裸鼠皮下成瘤实验显示,敲低LINC00284表达的甲状腺乳头状癌细胞体内移植瘤生长能力显著减弱,免疫组化检测发现下调LINC00284表达后,Ki-67表达量显著降低。结论:敲低lncRNALINC00284的表达可显著减弱甲状腺乳头状癌细胞体内外的增殖能力,并且能够抑制细胞周期进程,诱导细胞凋亡。第三部分:LncRNALINC00284通过调控miR-3127-5p/E2F7促进甲状腺乳头状癌增殖的机制研究目的:探索LINC00284在甲状腺乳头状癌中的分子作用机制。方法:（1）通过生物信息学网站CPAT 3.0和CPC 2.0分析LINC00284是否具有编码蛋白的潜能;（2）使用在线工具“lncLocator”预测LINC00284的细胞定位,随后通过 RNA 荧光原位杂交实验（RNA fluorescenceinsituhybridization,FISH）和核质分离实验进行验证;（3）通过lncRNASNP2和RegRNA 2.0网站筛选可能与LINC00284结合的miRNAs,并通过qRT-PCR检测验证;（4）采用双荧光素酶报告基因和 RNA 结合蛋白免疫沉淀（RNA bindingproteinimmunoprecipitation,RIP）实验验证LINC00284与miRNA的结合;（5）在甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织中,采用qRT-PCR检测miRNA的表达量,并分析LINC00284表达与miRNA表达的相关性;（6）利用Targetscan、DIANA和miRDB网站寻找miRNA下游靶基因,并结合TCGA数据库,初步筛选miRNA候选靶基因;（7）Western blot检测下调miRNA表达后靶基因表达水平的变化,并通过双荧光素酶实验验证miRNA与靶基因的结合;（8）qRT-PCR检测靶基因的表达,分析靶基因与miRNA表达以及靶基因与LINC00284表达的相关性;（9）在甲状腺乳头状癌细胞中共转染LINC00284siRNA（或miRNA靶基因siRNA）和miRNA inhibitor,进行功能挽救实验;（10）采用基因功能富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）预测 LINC00284 调控的信号通路,并通过 western blot验证。结果:（1）CPAT 3.0和CPC 2.0网站结果均显示LINC00284不具备编码蛋白的潜能;（2）在线工具lncLocator预测结果、FISH和核质分离实验结果均显示LINC00284主要定位于甲状腺乳头状癌细胞的细胞浆中;（3）通过lncRNASNP2和RegRNA2.0筛选出 4 个可能与 LINC00284 结合的 miRNAs（miR-499a-3p、miR-1914-5p、miR-3127-5p 和 miR-3692-5p）,qRT-PCR 检测显示敲低 LINC00284 表达后,miR-3127-5p表达显著升高,确定其为后续研究对象;（4）双荧光素酶报告基因和RIP实验显示LINC00284可与miR-3127-5p结合;（5）qRT-PCR检测显示,miR-3127-5p在甲状腺乳头状癌组织中表达较癌旁组织中降低,在甲状腺乳头状癌组织中miR-3127-5p表达和 LINC00284 表达呈负相关（R=-0.507,P＜0.001）;（6）通过 Targetscan、DIANA 和miRDB生物信息学工具,筛选出130个miR-3127-5p潜在的靶基因,然后结合TCGA数据库,我们筛选出7个在甲状腺癌组织中表达量明显高于癌旁组织的mRNA作为候选靶基因（TNNI1、CLIP3、ETV5、ACOT12、E2F7、FAXC 和 MISP）（fold change≥2,P＜0.05）;（7）Western blot检测显示,敲低miR-3127-5p表达后,E2F7表达显著上调,确定其为后续研究对象,双荧光素酶报告基因实验显示miR-3127-5p可与E2F7结合;（8）qRT-PCR检测发现,E2F7在甲状腺乳头状癌中的表达量显著高于癌旁组织,且在甲状腺乳头状癌组织中E2F7表达和miR-3127-5p表达呈负相关（R=-0.325,P=0.005）,E2F7 表达和 LINC00284 表达呈正相关（R=0.620,P＜0.001）;（9）回复实验显示,miR-3127-5pinhibitor可部分挽救LINC00284表达下调引起的细胞增殖能力减弱,下调E2F7表达可逆转miR-3127-5p inhibitor对细胞增殖能力的促进作用;（10）GSEA结果显示与Hedgehog信号通路相关的基因在LINC00284高表达组显著富集。Western blot检测发现敲低LINC00284表达,可以下调Hedgehog信号通路相关蛋白SHH、PTCH1和GLI1的表达。结论:LncRNALINC00284可以充当分子海绵,竞争性结合miR-3127-5p,解除了部分miR-3127-5p对E2F7的抑制作用,激活Hedgehog信号通路,进而促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖。这一发现有可能为甲状腺乳头状癌提供新的治疗靶点。总结1.LncRNALINC00284和E2F7在甲状腺乳头状癌组织和癌细胞中高表达,miR-3127-5p低表达;LINC00284高表达的患者肿块体积更大;2.LncRNALINC00284在甲状腺乳头状癌中发挥促癌作用,通过内源性竞争结合miR-3127-5p,导致下游靶基因E2F7表达升高,进而促进甲状腺乳头状癌细胞的体内外增殖,促进细胞周期进程,抑制细胞凋亡;3.LncRNA LINC00284/miR-3127-5p/E2F7 功能轴通过激活 Hedgehog 信号通路,促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖。