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食品安全问题一直是一个世界范围内的公共卫生安全问题。近年来，食品安全事件频发,食品安全问题引起了国际社会的广泛关注。致病菌污染是导致食源性疾病感染的主要因素,加强食品中致病菌的检验力度是解决这一问题的最有效的途径。目前，国内检测食品中致病菌主要采用传统的分离、培养、生化鉴定的方法，其操作繁琐，检测时间较长，通常需要一周才能完成，且灵敏度较低，已经不能满足食品中致病菌快速灵敏检测的需要。PCR检测方法具有高效、低成本、高灵敏度等优点，但是普通PCR每次只能检测一种或一类致病菌，一旦检测方向有误就会造成时间和药品浪费。多重PCR与普通PCR原理相同，但能同时检测多种食源性致病菌，弥补了普通PCR的缺点，节省了成本和时间，作为一种快速、高效且高通量的检测方法在在致病菌检测领域有着广泛的发展空间。多重PCR是一种在同一反应体系中加入针对多个靶基因分别设计的一对特异性引物，同时扩增出多条目的基因片段的扩增方法。本文以编码小肠耶尔森氏菌黏附侵袭的ail基因、大肠杆菌O157:H7基因组中的ECs3032序列和沙门氏菌的invA基因，分别设计一对特异性引物进行PCR扩增，实现对三种食源性致病菌的检测。再利用正交试验方法设计L16（44）正交表，对影响多重PCR反应的四个关键因素进行初步优化，再采用固定其他因素改变单一因素的方法进一步进行优化，确定多重PCR反应最终体系为25μL：10×PCR buffer2.5μL，Mg2+（50mmol/L）、dNTPs（各2.5mmol/L）各2.0μL，模板各1.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1.5μL，0.4μL Taq酶（5U/μL），加灭菌蒸馏水补足25μL；多重PCR扩增程序为:多重PCR反应采用冷启动，预变性94℃5min;变性94℃1min、退火54.1℃1min、延伸72℃2min,共进行30个循环;72℃延伸10min，反应产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果。进行引物特异性和反应特异性试验，证明该方法具有较好的特异性。扩增产物进行测序，并将测序结果在GenBank上进行在线BLAST比对，以验证方法特异性。证实了扩增产物与目的基因同源性分别为99.15%、99.71%、97.61%。在最佳实验条件下，多重PCR同时检测三种食源性致病菌纯培养物的灵敏度均为103CFU/mL；采用试剂盒法提取DNA，人工污染鸡肉样品经9h富集培养增菌后，三种致病菌在鸡肉中的最低检出限沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7为103CFU/mL，小肠结肠炎耶尔森氏菌可达到102CFU/mL，其灵敏度和检出限均略低于单重PCR检测。对实际样品进行检测，并与国标法进行比较，证明该方法检测三种食源性致病菌具有较高的特异性和灵敏度。