道地药材是传统中医长期临床实践公认的品质好疗效佳的优质中药材,是自古延用至今评价中药材质量的一项独特综合性标准,阐明药材道地性的物质基础是道地药材可持续利用的必要前提。黄岑是唇形科(Lamiaceae)黄零属植物黄芩(Scutellariabaicalensis Georgi)的干燥根,具有清热解毒、泻火燥湿、止血安胎等功效,并具有抗菌、抗癌防癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、降压、保肝利胆等现代药理作用。黄芩分布区为我国秦岭以北的12个省,即“三北”地区(东北、华北和西北),主要生态环境有草甸草原、针阔混交林、灌丛和山地草原,自1958年以来开始对黄芩大面积的栽培。黄芩的道地性比较明显,尤以河北承德及周边地区所产的黄芩为最佳,素有“热河黄芩”之称。黄芩为多年生草本植物,肉质根,虫媒传粉,种子繁殖。黄芩的分布和栽培状况、繁育系统、药材特性等代表了一大类药用植物,以其为材料研究道地药材形成的遗传和化学物质基础研究具有很好的代表性。本文以28个野生居群的黄芩为材料,应用分子谱系地理学和群体遗传学的理论和方法,结合UPLC-Q-TOF-MS技术对代谢轮廓及化学成分差异性进行了总体分析,探讨黄芩道地性的遗传和化学物质基础,为黄芩引种栽培和品种选育提供科学依据,为探讨黄芩种质资源的保护和利用奠定了研究基础。主要研究结果如下:1.叶绿体基因组分析利用short-range PCR方法对黄芩两个个体的叶绿体基因组进行测序和组装,并将其与黄芩属其他两个叶绿体基因组进行比较分析。结果显示两个黄芩叶绿体基因组全长分别为151,817bp和151,824bp,具有典型被子植物叶绿体基因组环状四分体结构。共注释得到114个基因,其中包括80个蛋白质编码基因,30个tRNA基因和4个rRNA基因。通过对黄芩属三个物种的叶绿体基因组进行比较,筛选出可能用作DNA条形码的六个高变片段(trnH-psbA,trnK-rps16,petN-psbM,trnT-trnL,petA-psbJ和ycfl)。而两个黄芩叶绿体基因组之间有25个SNPs和29个indels,所有的SSR-indels均发生在非编码区域内。系统发育分析表明,黄芩亚科是野芝麻亚科的姊妹群。上述结果为全面深入研究黄芩的分子谱系地理学奠定了坚实的理论基础。2.分子谱系地理学研究应用 3 个 cpDNA 序列ycf4-cemA,petA-psbJ和psbA-trnH对黄零(S.baicalensis)28个野生居群和甘肃黄芩(S.rehderiana)1个野生居群进行了分子谱系地理研究,结果表明,黄芩和甘肃黄芩之间存在显著的遗传分化,种间没有基因渗透和杂交。黄芩3个cpDNA片段的联合分析发现29个变异位点,形成50个单倍型,其中11种道地产区特有单倍型(Hap17、Hap20、Hap26、Hap27、Hap28、Hap32、Hap34、Hap35、Hap36、Hap37和Hap43)可作为道地黄零初步产地鉴别的分子地理标识。黄芩种内具有较高的单倍型多样性(Hd=0.88)和核苷酸多样性(π= 1.58),道地产区的遗传多样性高于非道地产区的遗传多样性,同时,黄芩道地产区的面积在整个分布区中所占比例很小,但却集中分布了 40种单倍型,占到所有单倍型的80%,因此推测黄芩的道地产区是黄芩的多样化中心。AMOVA分析表明遗传变异主要发生于居群间(75.84%),且遗传分化程度较高FST= 0.758,基因流较低Nm = 0.1596,呈现出受距离影响的有限基因流的谱系地理模式。遗传距离与地理距离的相关性分析表明两者之间显著相关(= 0.33,P<0.01),可见单倍型地理分布显著结构化。网状进化树和地理分布图结果显示最原始的单倍型主要分布区正好是黄芩的道地产区。NJ聚类和STRUCTURE聚类分析,都支持将黄芩的28个野生居群分为3组,以承德及周边地区的居群表现的单倍型聚为道地产区(华北组),以秦岭淮河(陕西、甘肃、河南)和山东山西的居群表现的单倍型聚为道地产区以南(西北组),以东北三省和内蒙古的居群表现的单倍型聚为道地产区以北(东北组)。种群动态分析表明,道地产区的有效居群数明显大于非道地产区的,道地产区到两个非道地产区之间都有双向的基因流,但是非道地产区之间没有基因交流。由此推断黄芩的道地产区是黄芩的起源中心。3.群体遗传学研究应用10对SSR标记分析了 28个黄芩野生居群的遗传多样性和遗传结构,结果显示道地产区的遗传多样性较高(Ho = 0.568,He = 0.633,Na=5.432,Ne= 3.395,I=1.287),推测道地产区可能是黄芩的遗传多样性中心。分子方差变异分析揭示遗传变异主要存在于黄芩的居群内部(87.85%),居群间的遗传分化较小(FST=0.1391),而基因流较大(Nm = 1.5472),这与叶绿体片段分析的结果正好相反,说明对于黄芩的基因流,花粉流的贡献度要远大于种子流的。遗传距离和地理距离显著相关(r = 0.61,P<0.01),而与海拔距离无显著相关,说明居群间遗传分化的地理因素主要是受空间地理距离引起的。基于等位基因频率的Nei(1983)遗传距离构建的UPGMA聚类结果显示道地产区分散在道地产区以北和道地产区以南的居群中。STRUCTURE聚类分析结果进一步验证了道地产区以北居群和道地产区以南居群呈现出两个独立进化的路线,以承德及周边地区的居群表现的基因型聚为道地产区(华北组),以秦岭淮河(陕西、甘肃、河南)和山东山西的居群表现的基因型聚为道地产区以南(西北组),以东北三省以及内蒙古的居群表现的基因型聚为道地产区以北(东北组),推测道地产区可能是黄芩的起源中心。结合cpDNA数据,我们筛选了 11种道地产区特有单倍型可作为黄芩初步产地鉴别的分子地理标识,进一步确定了黄芩的道地产区(热河地区),即承德及周边地区,可能是黄芩的多样化中心和起源中心,其北面的燕山山脉和西面的太行山脉形成了第四纪冰川的天然屏障,使其可能成为冰期东北和西北植物的避难所,优越的地理气候条件和适宜的生态环境形成了黄芩的道地性。4.代谢组学研究应用UPLC-Q-TOF-MS结合多维统计分析方法对28个黄芩野生居群进行代谢组学分析,共鉴定出29种化学成分。系统聚类分析与PCA分析将黄芩划分为三种化学型,揭示了不同产地黄芩化学成分差异的客观性,道地黄芩的代谢特征明显不同于非道地产区,这与遗传的聚类分组基本相吻合。鉴定出区分不同产区黄芩的4个差异代谢物,分别为 Dihydroxy-dimethoxyflavone-7-glucuronide、Wogonin、Apigenin-7-diglucuronide 和Trihydroxy-methoxyflavone glucuronide,可以作为生物标记物。不同产区4个差异成分含量均有不同程度的差异,其中 Apigenin-7-diglucuronide 和 Trihydroxy-methoxyflavone glucuronide在道地产区的相对含量明显高于其他产区,可作为黄芩道地性的化学指标性成分。优越的地理气候条件和适宜的生态环境造成了谱系分选,形成了现代黄芩的遗传分化模式,这种遗传分化模式决定了化学表型的地理变异格局,最终形成了黄芩的道地性。结论:化学成分的地理变化与叶绿体单倍型的遗传分化和核基因遗传差异存在一定的相关性,很大程度上受到了遗传因素的影响。虽然道地居群不是一个进化显著单元,但已具有明显特化的单倍型和基因型,道地产区位于黄芩分布区中心的优越地理环境保存许多特化的单倍型和基因型,并使之优质性得以表达,因此,黄芩道地性的形成应是遗传与环境之间相互作用的产物。